[发明专利]快速高效的临床级色素上皮细胞诱导方法、试剂盒及应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及快速高效的临床级色素上皮细胞诱导方法、试剂盒及应用。本发明提供了一种快速高效诱导视网膜色素上皮细胞的方法，通过3个阶段，定向诱导iPSC，极大的缩短了RPE产生时间；具体地，所述方法包括使用含有小分子化合物的培养基进行细胞培养，所述小分子化合物包括BMP信号通路抑制剂，Wnt通路抑制剂，TGF‑βI型受体ALK5、ALK4和ALK7的抑制剂，ROCK通路抑制剂，WNT信号通路激活剂，VEGFR激酶抑制剂，GSK信号通路抑制剂，VEGFR激酶抑制剂，维生素及其类似物。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及快速高效的临床级色素上皮细胞诱导方法、试剂盒及应用。

背景技术

眼是人类的重要器官，而视网膜退行性疾病可致盲，给患者带来极大的痛苦。视网膜退行性疾病主要包括视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)、黄斑变性以及遗传性视网膜退行等，这些疾病存在着不同的症状以及相关致病基因或易感基因。尽管这些疾病的病因和病理进程各不相同，但都存在视网膜细胞数量的进行性减少，主要包括视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)和光感受器细胞的不可逆损失，并最终导致视觉功能丧失。RP为遗传性疾病，目前已发现200多个与RP相关的基因突变位点。黄斑变性是由基因改变和环境因素共同引起，根据患病年龄分为少年黄斑变性和年龄相关性黄斑变性(age related-macular degeneration，AMD)。临床上RP和AMD较为普遍，其中RP的发病率高达1/3000；而AMD在大于60岁的人群中的发病率超过1/10。目前，临床上用来治疗视网膜退行性疾病的药物和方法非常有限，多数为抗炎治疗及神经细胞营养保护性视网膜退行性疾病药物用以延缓病程，或者抑制血管生长类药物以治疗湿性AMD等。

但是药物治疗无法恢复已经受损的视神经细胞和功能RPE细胞，而利用细胞移植手段则可以有针对性地将有特定功能的细胞移植并整合到视网膜中以恢复其受损功能，应用前景更为广泛。目前，细胞移植是治疗退行性眼病的重要方法之一。针对视网膜退行性疾病的细胞替代疗法形式的再生医学具有广阔的前景，因为无论潜在的遗传原因或后天原因，均可使用相同的治疗剂。现代干细胞技术已经产生了临床级别的细胞疗法，目前正在研究人类胚胎干细胞(hESCs)和诱导性多能干细胞(iPSCs)治疗视网膜变性。目前的分化方法存在的主要不足在于诱导分化耗时长(90-140天)，以及移植后RPE(视网膜色素上皮细胞)的功能性差和存活率低。

发明内容

本发明提供了一种快速高效诱导视网膜色素上皮细胞的方法，通过外胚层分化、色素上皮前体细胞分化、视网膜色素上皮细胞成熟这3个阶段，定向诱导iPSC，极大的缩短了RPE产生时间；每个阶段针对特定的信号通路，促进iPSC分化。

本发明所提供的方法能够缩短诱导分化时间，并且能得到功能和活力均比较稳定的RPE细胞，最终可以用于移植治疗。同时，本发明提供了诱导视网膜色素上皮细胞的培养基、培养基组合、试剂盒及其应用。

第一方面，本发明提供了一种快速高效诱导视网膜色素上皮细胞的方法，所述方法包括诱导外胚层分化的步骤和诱导色素上皮前体细胞分化的步骤。

优选地，所述方法还包括诱导视网膜色素上皮细胞成熟的步骤。

优选地，所述方法还包括视网膜色素上皮细胞传代的步骤。

本发明中“色素上皮细胞”“视网膜色素上皮细胞”“RPE”均表示相同含义，可以互换使用。

在一种实施方式中，所述诱导外胚层分化的步骤包括使用RDM1培养基和/或RDM2培养基培养干细胞。

优选地，所述干细胞包括全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞。

优选地，所述干细胞是iPSC细胞(诱导性多能干细胞)。