[发明专利]猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用。本发明将猪流行性腹泻病毒的Nsp9蛋白进行了原核表达，其蛋白产量相当高，另外，本发明首次证明重组Nsp9的原核表达可在小鼠体内诱导活跃的体液和细胞免疫，Nsp9蛋白免疫鼠产生的Nsp9抗体滴度达1:64000，MBP‑Nsp9蛋白免疫鼠产生的Nsp9抗体滴度高达1:128000。同时证明了MBP可增强Nsp9的免疫诱导能力，上述结果表明，PEDV的Nsp9蛋白可用于制备PEDV诊断试剂和疫苗。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea virus,PEDV)主要引起仔猪严重呕吐、腹泻、脱水和死亡。2010年以来，PEDV变异株所致的腹泻在中国、美国等多个国家流行，初生仔猪的发病率和死亡率均高达100％。PEDV感染猪类造成了的严重后果，给许多国家的养猪业带来了巨大的经济损失。PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属成员，其基因组为单股正链RNA，包括至少7个开放阅读框(ORF)，按照ORF1a/ORF1b-S-ORF3-E-M-N的顺序排列。ORF1a编码病毒多聚蛋白pp1a，pp1a蛋白被裂解成非结构蛋白nsp1～nsp16。其中，Nsp9具有结合RNA和DNA的活性，可形成二聚体，参与病毒复制，还可能具有在RNA合成中防止新生核酸被核酸酶降解的作用。但是，关于Nsp9免疫性能的研究目前尚未见报道。

发明内容

本发明首次发现Nsp9免疫小鼠可诱导体液及细胞免疫反应，MBP能增强Nsp9的免疫诱导能力，上述结果表明，PEDV的Nsp9蛋白可用于制备PEDV诊断试剂和疫苗。

本发明的技术方案为：

本发明分析了PEDV的非结构蛋白9(Nsp9)，分析了其空间结构和B细胞抗原表位，合计预测了6个B细胞抗原表位。然后，根据CV777的Nsp9序列委托公司合成,并进行密码子优化，根据优化后的密码子，设计引物，将Nsp9克隆至pET-28a载体，获得Nsp9融合表达载体pMAL-c2x-MBP-Nsp9(表达融合蛋白MBP-Nsp9)和Nsp9单独表达载体pET-28a-Nsp9。通过PCR、酶切和测序鉴定。将重组表达载体pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9，和pMAL-c2x-MBP_TFF转化原核表达菌株BL21，优化诱导表达条件(温度、时间和IPTG浓度)，结果表明在32℃、1mM IPTG诱导8小时可获得较高表达的重组蛋白MBP-Nsp9。并同时表达重组蛋白Nsp9和MBP_TFF。然后，利用SDS-PAGE和Western Blot检测重组蛋白的表达，Ni柱纯化表达蛋白。

将纯化的表达蛋白(MBP-Nsp9、Nsp9和MBP_TFF)分别腹腔注射免疫3～5周龄雌性BALB/c鼠，PBS溶液免疫的鼠作为阴性对照，收集小鼠血清并通过间接ELISA检测其抗体滴度。结果表明：Nsp9免疫小鼠抗体效价高达1:64000，MBP-Nsp9免疫小鼠抗体效价高达1:128000。进一步的Western blot和间接免疫荧光检测结果表明，Nsp9多克隆抗体能特异性识别重组Nsp9蛋白和PEDV感染的细胞Nsp9蛋白。qPCR检测小鼠外周血细胞因子水平，结果显示IL-1β、TNF-α、IFN-γ上调表达，IL-4和IL-10下调表达。上述结果表明Nsp9蛋白能诱导细胞免疫。总的来说，本发明结果显示Nsp9免疫小鼠可诱导体液及细胞免疫反应，MBP能增强Nsp9的免疫诱导能力。

上述PEDV的Nsp9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，MBP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的有益效果为：