[发明专利]一种基于光杠杆原理和肽核酸的微悬臂梁核酸检测技术

说明书

本发明用肽核酸(PNA)替代传统单链DNA(ssDNA)固定到微梁金表面上的方法，可以提高表面探针密度，提升对目标核酸的捕获效率，在基于光杠杆的检测模式下，这样带来了极大的表面应力增强；控制肽核酸的链长，有效的提高应力增强的效果。本方法已成功应用与新冠病毒核酸和肺癌临床标记物检测，与基于ssDNA的微悬臂梁核酸检测技术相比灵敏度提高高达7个数量级，该技术有望普及于多领域的核酸检测。

技术领域

本发明涉及一种基于光杠杆原理和肽核酸的微悬臂梁核酸检测技术，已证明可应用于新冠病毒和癌症诊断等多领域的核酸检测。

背景技术

目前，生物传感器常用的核酸检测探针是单链DNA(ssDNA)。然而，ssDNA在固定时表现出不可控的方向和塌陷的构象。同时，ssDNA带负电荷的糖-磷酸盐骨架导致ssDNA彼此之间的排斥，限制了ssDNA在传感器表面修饰时的间距。所有这些因素都会导致每个ssDNA占据更大的空间面积，从而限制了ssDNA在有限的传感器表面上的修饰密度。此外，当与目标核酸(带负电)杂交时，ssDNA和目标核酸结合时彼此间的静电排斥也会影响ssDNA的亲和力，无法高效的对目标核酸进行捕获。在实际检测中，ssDNA也可能会被样品中的核酸酶或蛋白酶降解，其活性也会受到离子浓度、温度和pH的影响。由于上述限制，基于ssDNA的生物传感器对核酸的直接检测极限都在nM量级。为了提高检测灵敏度，研究者尝试用其他材料辅助的方式或对目标核酸扩增的方式以优化检测能力。检测限虽都得到了一定程度的降低，但检测过程却被大大复杂化了。这些方法显然是不符合现实检测的需求的，不易于普及。

其他生物传感器的灵敏度取决于探针分子的亲和力。高亲和力的探针分子可以实现高效的分析物捕获，从而提高检测灵敏度。微梁传感器的工作原理是探针和分析物的结合引起的微梁表面的应力变化会引起微梁的实时偏转。由于微梁的刚性系数非常小，以及光学杠杆对偏转的放大作用，可以实现对分析物的高灵敏度测定，而不需要复杂的标记过程。而微梁表面的应力变化大小则与探针分子的亲和力，探针分子的空间构象和形成的复合物(探针-靶分子)的紧密程度息息相关，这使得微梁传感器对于探针的需求是独特的。理想情况下，如果有一种高亲和力的探针分子在微梁表面可以形成密集和定向的分子层，那么就可以实现对靶分子高效率的捕获。之后紧密排布的复合物彼此间就会产生较大的排斥力，最终产生巨大的总排斥力引起微梁的显著的偏转，从而可以大大提高微梁传感器的灵敏度。

一种核酸类似物，肽核酸(PNA)，是通过用中性聚酰胺骨架取代DNA的带负电荷的磷酸糖骨架而合成的。PNA保留了碱基特异性杂交的特性，在识别互补目标方面仍然有效。但由于中性聚酰胺骨架的灵活性，PNA在核酸杂交中展现出超高的亲和力，并可以在空间上定向的垂直伸展，充分的暴露碱基。这使得PNA在微梁表面可以形成高密度且定向的探针分子层，从而高效的捕获目标核酸，最终形成大量且密集排布的探针-目标核酸双链体。双链体彼此间很小的间距大大增加了排斥力，给微梁表面带来了显著的应力增强。此外，PNA表现出抗酶水解的能力，并且不受进行杂交的溶液环境(离子浓度、温度、pH值等)的影响，这使得PNA在复杂条件下也可以进行稳定的核酸检测。

在全球肆虐的新冠病毒感染的主要诊断方法目前是新冠病毒核糖核酸(RNA)的分子检测和免疫学抗体检测。核酸检测是通过处理人类血液、粪便或呼吸道的样本后，提取病毒RNA进行逆转录酶实时聚合酶链反应(RT-PCR)。虽然RT-PCR表现出良好的检测限(500copies/mL)，但其产生结果的周期较长(数小时至数天)，主要是由于核酸纯化和扩增等繁琐步骤造成的。最重要的是，RT-PCR需要专门的操作人员和昂贵的设备(10000美元)，且只能在拥有大型固定设备和试剂的实验室操作，这大大限制了资源匮乏地区的检测能力。免疫学抗体检测易于操作，对设备的依赖性较小，但受限于人类免疫系统可能需要14至21天才能产生待检测的抗体，并可能受到交叉反应的干扰。此外，癌症的诊断越早，治愈率就越高，而现有对癌症临床标记物(microRNA)的检测方法的灵敏度仅在纳摩尔量级。考虑到病毒检测和癌症诊断现有检测方法的缺陷及为了验证本发明技术的实用性，我们将发明技术用于SARS-CoV-2的RNA的检测和肺癌临床标记物miRNA-155的检测。