[发明专利]分离胎儿滋养层细胞的方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种分离胎儿滋养层细胞的方法及试剂盒。具体地，本发明涉及用于分离纯化胎儿滋养层细胞的抗体组合，包括用于负筛选的抗体和/或用于正筛选的抗体。本发明还涉及分离胎儿滋养层细胞的方法和试剂盒。其中所述方法包括以下步骤：（1）获得包含滋养层细胞的母体组织样本；（2）制备组织样本单细胞悬液；（3）免疫磁珠法富集胎儿滋养层细胞；（4）细胞分选仪分选胎儿滋养层细胞。其中所述试剂盒包含以下试剂：（a）用于免疫磁珠法富集胎儿滋养层细胞的试剂；和/或（b）用于样本清洗的试剂。

技术领域

本发明涉及一种利用免疫磁珠法富集与细胞分选仪分选相结合的细胞分离技术。具体地，本发明涉及一组用于分离纯化胎儿滋养层细胞的抗体组合，包括用于负筛选的抗体和用于正筛选的抗体。本发明还涉及一种分离母体组织样本中胎儿滋养层细胞的方法以及适用于该方法的试剂盒。

背景技术

在胚胎发育成桑椹胚并进一步发育过程中，开始出现分化沿透明带内壁扩展和排列的一种个体较小的细胞，即为滋养层细胞。在内细胞团发育过程中，由滋养层细胞和胚外中胚层的壁层构成绒毛膜。随着胚胎发育，丛密绒毛膜与基蜕膜共同构成了胎盘，而平滑绒毛膜则和包蜕膜一起逐渐与壁蜕膜融合。在此过程中，脱落的滋养层细胞即绒毛外滋养层细胞（Extravillous trophoblast, EVT）进入宫颈。

胎儿滋养层细胞可以作为一种胎儿遗传物质的来源，用于进行无创产前诊断¹。因此纯化出高纯度的滋养层细胞，具有非常重要的临床应用意义。

目前也有报道，从母体血液中可富集获得滋养层细胞²；但母体血液中胎儿滋养层细胞的数量非常稀少，大约10⁸个母体细胞中含有1个胎儿滋养层细胞，从母体血液中分离胎儿滋养层细胞非常困难。

利用滋养层细胞的特异性表面抗体anti-HLAG染色的实验表明，宫颈刮片样本中滋养层细胞的比例大约是1/2000³。目前已报道的纯化宫颈样本滋养层细胞主要有显微切割和微流控两种技术^{4, 5, 6}。但两种方法操作周期都非常长、成本昂贵并且对设备和实验人员的操作技术要求都很高，而且技术和临床应用可行性并没有得到充分验证。

利用细胞分选仪分选是一种常规且成熟的细胞分选技术，但由于大量背景细胞对特异性细胞染色的干扰，对于纯度小于0.1%甚至1%的细胞分离仍然存在很大难度。即使在抗体非常特异的情况下，流式细胞仪分离纯度也只能达到20%左右甚至更低⁷。由于宫颈刮片样本中存在许多细胞碎片和宫颈本身存在细菌感染等因素，实际流式分选时滋养层细胞的纯度可能远小于1/2000。而宫颈刮片样本中宫颈粘液的干扰，又给滋养层细胞的纯化带来更多难度。因此，在利用细胞分选仪分选前，对宫颈样本等母体组织样本中的滋养层细胞进行有效富集至关重要。

免疫磁珠法利用细胞表面特异性抗原和抗体结合，并利用磁力直接富集目标细胞（正筛选）或去除非目标细胞（负筛选）。正筛选一般可以达到几倍到几十倍的富集效果⁸，而负筛选一般可以达到几倍到几百倍的富集效果⁹。HLAG特异性在滋养层细胞上表达，可利用anti-HLAG进行滋养层细胞正筛选。而利用多种抗体进行正筛选会增加滋养层细胞的得率。目前尚无利用免疫磁珠负筛选法进行滋养层细胞富集的报道。

发明内容

本发明目的在于解决现有技术中，分离胎儿滋养层细胞操作复杂、周期长、成本昂贵、对实验人员的技术要求高的问题。

首先，本发明涉及一种抗体组合，其包括：

A）第一抗体；或

B）第二抗体；或

C）第一抗体和第二抗体；其中，