[发明专利]双功能载体及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物工程领域，具体涉及双功能载体及其制备方法和应用。本发明所述载体包含噬菌粒载体的基本元件，其特征在于，所述载体还包括编码表达抗体的多核苷酸序列、SASA标签蛋白基因序列和琥珀终止密码子，所述编码表达抗体的多核苷酸序列和SASA标签蛋白基因序列在琥珀终止密码子的上游。本发明的载体能实现双功能的切换，增加了额外的标签蛋白，提升了后续筛选检测时的准确性，为后续的筛选检测提供了更多的可能性，从而能够大大提高检测效率。

技术领域

本发明涉及抗体领域，具体涉及双功能的噬菌体展示载体，所述载体既可以在辅助噬菌体存在时进行抗体的噬菌体展示，又可以在诱导剂诱导下表达可溶性抗体。

背景技术

随着噬菌体展示技术的不断发展，采用噬菌体展示技术用于抗体筛选的方法和技术日益成熟。目前，行业内噬菌体展示载体有很多种，其中较为常用的一种为基于噬菌体外壳蛋白pIII的展示系统，该系统的技术原理是通过将目的抗体片段或肽与噬菌体pIII蛋白融合表达，通过加入辅助噬菌体来辅助噬菌体的组装及侵染来实现展示目的抗体片段或肽，一般而言，经过1-3轮淘选后再进行筛选的验证，进一步通过测序完成筛选抗体的鉴定。在进行1-3轮的淘选后的ELISA或者流式细胞筛选验证时，二抗的适用性和灵敏性至关重要。目前，在进行筛选验证时普遍采用针对噬菌体的特异性二抗(anti-M13-HRP)，而使用该二抗会存在假阳性即高背景信号的可能，因为筛选到的噬菌体展示抗体可能会存在非特异性的结合目标蛋白、细胞或酶标板^[1-2]，用anti-M13-HRP检测目标是噬菌体，所以可能存在背景较高的情况。为了进一步验证阳性克隆的准确性，需要把筛选得到的抗体序列进行可溶性的表达验证，而这个过程需要花费额外的时间来进行可溶性抗体的质粒构建和表达，实验周期较长^[3-4]。此外，目前现有噬菌体展示载体上标签蛋白的缺乏或单一也极大限制了后续验证方法的采用，例如可能出现的特定标签蛋白的非特异性结合，进而影响了抗体筛选效率，因此，这些问题都有待研究和提升。

发明内容

针对现有噬菌体展示技术所存在的问题，通过优化载体，本发明整合了抗体噬菌体展示和抗体可溶性诱导表达的功能，从而更好的解决了假阳性的问题，此外，通过添加更多的特异性标签蛋白，可以有更多的二抗可供选择，因而在后续的筛选验证时可以更加灵活的选择，达到验证的目的。

本发明一方面提供了一种表达载体，所述载体包含噬菌粒载体的基本元件，其特征在于，所述载体还包括编码表达抗体的多核苷酸序列、SASA标签蛋白的基因序列和琥珀终止密码子，所述编码表达抗体的多核苷酸序列和SASA标签蛋白的基因序列在琥珀终止密码子的上游。

在一些实施方案中，所述SASA标签蛋白包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少80％一致性的序列。在一些具体实施方案中，所述SASA标签蛋白包括与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少80％、至少83％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的序列。

在另一些具体实施方案中，所述SASA标签蛋白包括SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述SASA标签蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:1所示序列。

在一些实施方案中，所述琥珀终止密码子下游还包括编码肽接头的多核苷酸序列。在一些具体实施方案中，肽接头选自(EAAAK)_n、(Gly)_6-8、(AP)₇或GS接头，优选为GS接头。

在另一些具体实施方案中，所述肽接头为GS接头，所述GS接头为(G₄S)₃或GGGGSGGGS。

在一个具体实施方案中，所述肽接头为(G₄S)₃。