[发明专利]表达CAR和微小RNA的逆转录病毒载体及其应用

说明书

本发明提供一种表达CAR和微小RNA的逆转录病毒载体，该病毒载体中微小RNA与CAR共表达，所述微小RNA优选是miR155。本发明将miR155与anti‑CD19CAR共表达于CAR‑T细胞，实现miR155对CAR‑T细胞功能的同步调节，构建联合治疗方法。并对miR155anti‑CD19CAR‑T细胞进行体内、外功能验证，证明miR155anti‑CD19CAR‑T细胞在体内、外均具有较好的细胞活性、增殖能力与抗肿瘤能力。

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗技术领域，特别涉及表达CAR和微小RNA的逆转录病毒载体及其应用。

背景技术

微小RNA155(microRNA155，miR155)是微小RNA(microRNAs，miRNAs)家族成员之一，在进化过程中高度保守，在转录后水平通过不完全碱基配对识别和结合相应mRNA并将其降解，从而抑制靶mRNA翻译，调节其基因表达，参与调控体内多种生理和病理过程。miR155是最早发现的与炎症反应功能相关的miRNAs之一。

miR155位于人21号染色体短臂21位点，由长链非编码RNA转录本B细胞整合簇(B-cell Integration Cluster，BIC)编码，其表达水平受BIC转录及成熟miRNA加工过程的影响。miR155的产生与成熟过程与绝大多数miRNAs相同：首先，由细胞核内RNA聚合酶II转录为加帽和加多聚腺苷酸尾的初级转录本，然后，经Drosha核糖核酸酶III剪切，产生含茎环结构的前体miRNA，再转运至细胞质，经Dicer核糖核酸酶剪切，产生成熟的miRNA和反义miRNA产物。成熟miRNA参与形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)并发挥作用，识别靶mRNA，导致靶mRNA的翻译抑制。

miR155在机体免疫调节中发挥重要作用，参与固有免疫应答，促进巨噬细胞促炎表型的获得，影响树突状细胞迁移、表型和抗原提呈活性，并影响B细胞和T细胞功能，在维持淋巴细胞稳态和正常免疫反应中起着重要作用。miR155在T细胞的激活、增殖、分化发育和凋亡等各方面均发挥一定的调控作用。

miR155能直接靶向抑制CTLA-4从而降低T细胞的CTLA-4表达水平并促进其活化与增殖，直接靶向抑制FOXO3来抑制T细胞凋亡，或直接靶向SHIP-1间接影响FOXO3的活性从而提高活化的T细胞的存活率。

miR155参与调控T细胞的分化与功能，通过靶向抑制幼稚T细胞分化成不同亚群过程中所必需的细胞因子、信号通路及其特异性转录因子，调节基因的表达，从而影响T细胞的分化与功能。多种转录因子参与其中，例如SOCS1、SHIP1、S1PR1、PU.1、c-Maf、STAT、RoR-γt、Fosl2等。

miR155参与调控CD4+T细胞的分化，包括调节Th1/Th2细胞平衡、Th17/Treg细胞平衡、Tfh细胞分化。有研究发现miR155过表达能促进幼稚CD4+T细胞分化为Th1细胞，而miR155缺失能促进Th2细胞的分化。miR155主要通过调节IFN-γ信号而促进Th1细胞分化，同时抑制Th2细胞分化，对T细胞发挥抗肿瘤功能具有重要意义。Th1细胞主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子，其中IFN-γ和IL-2能促进细胞毒性T淋巴细胞的增殖和分化，增强抗肿瘤免疫应答，TNF-α能诱导靶细胞凋亡，这些与T细胞抗肿瘤功能及T细胞增殖能力密切相关。