[发明专利]制备检测EP病原和ER病原试剂的试剂盒及其应用

说明书

本发明提供的制备检测EP病原和ER病原试剂的试剂盒及其应用，通过采用特定的引物组，结合在反应体系里加入金纳米颗粒、吸附ssDNA和蛋白酶，能够有效的避免在升温过程中的非特异性反应；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，既可以快速、准确的检测区分马焦虫与马鼻肺炎病原，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，实现一样双指标检测，又使得用户操作简便，显著提升检测效率，对于马焦虫病与马鼻肺炎的预防具有巨大的潜在开发价值。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及马相关病毒的检测方法及其应用，更具体的涉及马焦虫病病原和马鼻肺炎病原检测的试剂盒及其应用。

背景技术

马焦虫病(Equinepiroplasmosis)又称马巴贝斯虫病(Equine babesiosis)，是由蜱传播的马、骡、驴和斑马的一种原虫病。病原是两种血液寄生虫称为马泰勒氏焦虫(Theileria equi)和驽巴贝斯虫(Babesia caballi)，马泰勒氏焦虫旧称马巴贝斯虫(Babesiequi)。感染动物可长期携带这些寄生虫，成为传播媒介——蜱的感染源。这些寄生虫存在于感染动物的红细胞内。携带该寄生虫的动物引入蜱盛行地区后，可导致该病的地方性流行，流行高发是夏秋季，对养马业危害很大。现多采用采血涂片检查，要求检验者必须有一定的经验，否则易判断错误。

马鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis，ER)，又名马病毒性流产，是由马疱疹病毒引起的马属动物传染病。是马的一种急性发热性传染病，病原为马疱疹病毒Ⅰ型。临诊表现为头部和上呼吸道粘膜的卡他性炎症以及白细胞减少。妊娠母马感染本病时，易发生流产。国际兽医局(OIE)把马鼻肺炎列为B类疾病，被《国际动物卫生法典》(1999)列入法定报告疾病目录。本病在世界各地广泛发生，给世界养马业带来很大危害。目前检测方法有大体解剖、组织切片、抗体检测和利用PCR诊断。采用现有的PCR技术，由于其反应要在2个不同的温度区循环，对仪器要求高，成本也相对高昂，并且PCR技术仅仅1对扩增引物，易受干扰，特异性相对不足，且出结果时间较久，操作专业要求高，微量加量步骤多。而LAMP技术共有4条不同的特异性引物，故而检测结果准确度更高，但是由于是恒温反应，缺少类似PCR的热启动酶，在设备升温阶段容易产生非特异性扩增从而影响检测结果。

两种疾病作为导致马属动物主要烈性疾病的病原，现有检测技术中尚无针对两种疾病的多种病原同时检测效果较好的检测技术手段，严重阻碍了马焦虫病和马鼻肺炎的预防事业的发展。

发明内容

针对现有技术中存在的不足问题，本发明的目的在于提供制备检测EP病原和ER病原试剂的试剂盒及其应用，通过在反应体系里加入金纳米颗粒，吸附ssDNA和蛋白酶，有效的避免在升温过程中的非特异性反应；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，既可以快速、准确的检测区分马焦虫病与马鼻肺炎，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，实现一样双指标检测，又使得用户操作简便，显著提升检测效率，对于马焦虫病与马鼻肺炎的预防具有巨大的潜在开发价值。

本发明通过以下技术方案实现的：

本发明提供制备检测EP病原和ER病原试剂的试剂盒，所述的试剂盒中含有用于检测EP病原和ER病原的双重反应液，其中所述的双重反应液中含有用于检测EP病原的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示；包含用于检测ER病原的引物组，核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8所示。

优选的，所述的双重反应液中各引物对的浓度分别设置为90-180μM。

更优选的，所述的EP病原引物浓度为：SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2的引物浓度为90μM，SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4的引物浓度为180μM；EP病原引物使用量为SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2为0.5μL，SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4为2μL。