[发明专利]一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球及制备方法与应用

权利要求书

1.一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球，其特征在于，所述可吸入雾化微球包括生物膜、生物膜耦合器和雾化微球，所述生物膜通过生物膜耦合器与雾化微球固定连接；其中，所述生物膜耦合器通过静电吸附作用与所述生物膜耦合，所述雾化微球由甲基丙烯酸化透明质酸交联而成；所述生物膜耦合器为透明质酸微球形成的负电层，其通过静电吸附作用与带有正电荷的生物膜相耦合；所述生物膜为基因工程改造的ACE2蛋白高表达生物膜，所述基因工程改造是通过将人ACE2基因插入pcDNA3.1-3xFlag-C质粒载体，构建得到ACE2-pcDNA3.1-3xFlag-C载体。

2.根据权利要求1所述的基于生物膜耦合的可吸入雾化微球，其特征在于，所述可吸入雾化微球的直径为5-200μm，内部孔径为2-50μm。

3.根据权利要求1所述的基于生物膜耦合的可吸入雾化微球，其特征在于，所述ACE2-pcDNA3.1-3xFlag-C载体的具体构建方法为： A1：用50μL Opti-MEM培养基稀释0.8μg质粒DNA，混匀后室温下静置5min； A2：使用前混匀Lipofectamine TM 2000转染试剂，取2.0μL转染试剂用50μL Opti-MEM培养基稀释，混匀后室温下静置5min； A3：混合转染试剂和质粒DNA的稀释液，混匀后室温下静置20min，将转染复合物按100μL/孔加入到24孔细胞板中，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀，将细胞板置于37℃、5v/v％CO₂的培养箱中培养6h； A4：进行换液，换成含10％血清的普通培养基，在37℃、5v/v％CO₂孵育箱中继续培养24h，即得。

4.一种如权利要求1-3任一项所述基于生物膜耦合的可吸入雾化微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)透明质酸甲基丙烯酸酯的合成：以透明质酸和甲基丙烯酸酐为原料，通过酯化反应合成透明质酸甲基丙烯酸酯； (2)生物膜纳米囊泡的制备：将细胞用PBS缓冲液清洗，800g离心5min，收集HEK293-ACE2和Raw264 .7细胞，在细胞裂解液中于4℃过夜裂解细胞膜，然后在4℃下以20000g离心25min，收集上清液，再以100000g离心35min，收集含有膜的颗粒，用含有EDTA的水洗涤，用Bradford试剂定量膜含量，将所得的HEK293-ACE2膜和Raw264 .7膜以膜蛋白重量比1:1混合，超声融合，然后在微挤出机上挤出产物；其中，所述HEK293- ACE2细胞是通过导入人ACE2基因载体构建得到；所述Raw264 .7细胞是用脂多糖和干扰素处理得到； (3)吸入式ACE2工程微流控微球的制备：采用微流控装置制备吸入式ACE2工程微球，将500mg冻干的透明质酸甲基丙烯酸酯溶解于10mL含有0 .05g光引发剂的PBS缓冲液中作为内水相，然后以含5w/w％司盘80的石蜡油作为连续油相，将水相和连续油相分别以15mL/h和800mL/h的流速注入微流控装置，得到微流控微球，将微流控微球转移到细胞培养盘中，在波长为365nm的蓝光照射下交联30s，得到固化的水凝胶微球，用HEK293-ACE2和Raw264 .7膜包被水凝胶微球，将混合膜泡与水凝胶微球以质量比2:1～3:1孵育1h，对混合物进行超声处理，形成生物膜耦合的可吸入雾化微球。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述透明质酸甲基丙烯酸酯的具体制备方法按照如下步骤：将1g透明质酸加入含有30mL DMF的磷酸盐缓冲液中，60℃下溶解过夜，然后在连续搅拌下缓慢滴加8mL甲基丙烯酸酐和适量NaOH溶液，使pH值保持在8-9，然后加入甲基丙烯酸酐，在N₂气氛下于冰浴中继续反应24h，用5倍冰乙醇稀释反应后的混合物，离心收集沉淀物后将其溶解在水中，冷冻干燥储存，超纯水透析5天。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述细胞裂解液为低渗Tris－HCl缓冲液。

7.一种如权利要求1-3任一项所述基于生物膜耦合的可吸入雾化微球或如权利要求4-6任一项所述方法制备得到的基于生物膜耦合的可吸入雾化微球的应用，其特征在于，是将该可吸入雾化微球用于制备由新冠病毒或SARS病毒引起的肺炎疾病治疗方面的药物。