[发明专利]一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆及其制备方法与应用，属于病毒技术领域。本发明所用拯救系统在A型塞内卡病毒5’端上游引入CMV增强子、β‑actin启动子和核酶序列；在3’端下游引入核酶和终止子序列，通过RT‑RCR方法分段扩增SVA全长基因组片段，利用同源重组技术克隆至pOK12载体，构建含SVA/HeB全长cDNA的重组质粒。基于感染性cDNA克隆拯救得到的病毒为深入研究SVA的生物学特性、复制机制、致病机理及相关疫苗的研发奠定了基础，具有重要的科学应用价值。

技术领域

本发明属于病毒技术领域，尤其涉及一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆及其制备方法与应用。

背景技术

A型塞内卡病毒(SenecavirusA，SVA)属于小核糖核酸病毒科塞内卡病毒属成员，为无囊膜的单股正链RNA病毒。现已证实SVA感染猪能够引发原发性水泡病，引起猪的鼻吻、蹄部冠状带的水泡病变，同时伴有跛行、厌食、嗜睡和发烧等临床表现。与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎引起的临床症状难以区分。

2002年，美国科学家首次在细胞培养物中发现SVA。2015年以后，在加拿大、美国、巴西、泰国、中国等多个国家爆发了SVA疫情。通过回顾性监测和流行病学调查发现，SVA在我国多个地区流行和传播，并且流行范围越来越广。但是到目前为止对SVA的致病机制以及相关疫苗的研究甚少，而SVA反向遗传操作平台是研究SVA致病机制以及相关疫苗的关键工具。

SVA感染性克隆的构建大多基于传统的酶切将片段与载体连接，其主要包括两种方法：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。而同源重组技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶，并且克隆效率高，阳性克隆高达90％以上。

另外全长的cDNA合成以后可以利用两种方法来构建能够产生子代病毒的策略：RNA转染和DNA转染。在RNA转染策略中，病毒的RNA是在体外转录合成的，其使用的是T7或者SP6原核启动子，体外转录出病毒的RNA，然后转染到细胞中启动病毒的拯救过程，但此方法操作繁琐、不稳定且试剂昂贵。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆及其制备方法与应用。

本发明使用的DNA转染策略，首次采用真核双启动子CMV增强子和β－acitn启动子作为全长病毒基因组cDNA感染性克隆的上游，将完整的质粒直接转染细胞便可以得到感染性的病毒粒子，与其他专利中感染性克隆所使用的启动子相比，本发明所采用的构建策略具有更高的启动效率，拯救更快速便捷。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆，其拯救系统是在塞内卡病毒核酸序列的5’端上游插入CMV增强子、β-actin启动子和核酶序列；在塞内卡病毒核酸序列的3’端下游插入核酶和终止子序列。

本发明所用重组质粒的骨架载体为改造后的pOK-CMV-Actin。

在本发明中，将所述塞内卡病毒的核苷酸序列通过EcoR I酶切位点以同源重组方式插入pOK-CMV-Actin载体中。所述插入的塞内卡病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7示。