[发明专利]基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统

说明书

本申请提供了一种基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统，所述细菌底盘为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸芽孢杆菌或需钠弧菌细胞提取物；本申请还提供了各种底盘适合的密码子优化、感受态细胞、质粒浓度、RBS序列、无细胞体系试剂组分浓度等。本申请的体系都具有产生治疗性蛋白，例如SARS‑CoV‑2受体结合域蛋白的潜力。不同细菌底盘的无细胞蛋白质合成体系不仅可以扩大体外蛋白质生产的潜在选择，还可以通过扩大无细胞蛋白质合成平台来扩展体系的应用范围。

技术领域

本发明属于合成生物学蛋白合成领域，具体涉及一种基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统。

背景技术

无细胞蛋白质合成(cell-free protein synthesis，CFPS)是一种快速体外蛋白质合成的方法。基于提取物的CFPS体系作为工具，促进了基础生物学和应用生物学的发展。它们为蛋白质的生产和应用提供了一些独特的优势。例如，反应的开放环境允许用户直接添加或合成精确浓度的新成分，允许它们以更快、更方便、更可控的方式针对不同产品进行设计、测试和优化。较高的耐受性有利于有毒蛋白质产品的产生。此外，CFPS体系可以以冻干形式保存长达1年，显示出更大的稳定性。这些优势使CFPS体系成为路径设计、蛋白质生产和个性化药物的理想选择。因此，它们越来越多地被用于生产低表达率、聚集性、毒性和体内溶解性差的复杂蛋白产品。CFPS体系也具有广阔的应用前景，已用于DNA调节元件、逻辑体系的快速成型设计和生物传感器设备。

近年来，利用细胞生物合成的多样性，导致不同CFPS体系使用的宿主物种数量增加。理论上，任何生物都可以作为CFPS的基础。CFPS体系主要分为真核体系和原核体系。酵母、小麦胚芽、兔网织红细胞和昆虫细胞常被用作无细胞体系的真核宿主。真核细胞作为安全的宿主细胞，具有复杂的翻译后修饰功能，可以产生更复杂的蛋白质。然而，真核细胞培养成本高、过程复杂、批反应蛋白产率低，使得人们更倾向于研究原核宿主细胞CFPS体系。与真核体系相比，原核体系提取液制备更方便，蛋白质得率更高，下游加工要求更低，成本更低。目前，大肠杆菌是最流行和应用最广泛的原核CFPS体系。此外，采用不同模式菌株的原核宿主的无细胞体系，如弧菌、假单胞菌和芽孢杆菌近年来也开始发展。然而，这些研究只是建立了相关的体系，并没有对不同的CFPS体系进行比较分析。因此，需要进一步进行深入的探索和比较分析，以更好地指导体系的应用。

CFPS的发展需要集中在常见和有价值的典型底盘细胞，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌是实验室研究和工业生产的可靠和强大的基础微生物。他们有不同的特点，可以成为CFPS平台的重点研究对象。大肠杆菌作为目前CFPS体系的首选宿主细胞，具有明显的优势，如培养条件和细胞裂解方法操作简单，蛋白质产量最高可达数毫克/毫升，细胞培养成本低。枯草芽孢杆菌没有明显的密码子偏好，可以避免密码子优化，广泛应用于工业蛋白质生产。谷棒芽孢杆菌具有最小的蛋白酶活性，这使该菌株具有表达蛋白酶敏感蛋白的强大潜力。此外，枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌均属于革兰氏阳性菌株，为非致病性微生物，内毒素较少，可安全用于食品和制药蛋白的生产。需钠弧菌的倍增时间是大肠杆菌的两倍，能产生大量的核糖体来支持其健壮的转录体系的快速增长，使需钠弧菌有可能在高水平蛋白质表达领域获得卓越的生产力。上述特点使人们对基于这些菌株的CFPS体系的开发和使用产生了新的兴趣。

尽管有些CFPS体系(如大肠杆菌CFPS体系)发展较为完善，但是关于其他原核CFPS体系，如枯草芽孢杆菌、谷氨酸芽孢杆菌和需钠弧菌CFPS体系的相关研究还是很少。

发明内容