[发明专利]一种基于高通量测序的胃癌靶向治疗基因组文库的构建方法及引物

权利要求书

1.一种基于高通量测序的胃癌靶向治疗基因组文库的构建方法使用的引物，其特征在于：所述引物的序列为SEQ ID No.1 ~SEQ ID No.94。

2.一种基于高通量测序的胃癌靶向治疗基因组文库的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：

步骤1：从样品中提取基因组DNA；

步骤2：以权利要求1所述的引物，对步骤 1中提取的基因组 DNA 上的目的片段进行荧光 PCR 扩增，得到多重 PCR 扩增产物；

步骤3：对步骤2中得到的多重 PCR 扩增产物进行片段化、末端修复及纯化，并连接测序接头，构建基因组文库；

步骤4：对步骤C中构建的基因组文库进行高通量测序，获得目的基因片段的序列。

3.根据权利要求2所述的基于高通量测序的胃癌靶向治疗基因组文库的构建方法，其特征在于：步骤1 中，提取基因组 DNA 后对 DNA 进行质量检测，DNA 浓度大于 20 ng/μL，A260/A280  1.8，A260/A230  2.0。

4.根据权利要求2所述的基于高通量测序的胃癌靶向治疗基因组文库的构建方法，其特征在于：步骤2 中，荧光 PCR 扩增的反应体系为：25 μL的2XSYB Reaction Mix、10 μL的引物混合液、10-20 ng的DNA 模板，30-100μL的无核酸酶水；引物混合液由权利要求1中的94种引物组成，浓度均为100nM。

5.根据权利要求2所述的基于高通量测序的胃癌靶向治疗基因组文库的构建方法，其特征在于：步骤2 中，荧光 PCR 扩增的反应条件为：50℃，5 min，95℃，15min；94℃，15 s；35-45个循环，58℃，45 s。

6.根据权利要求2所述的基于高通量测序的胃癌靶向治疗基因组文库的构建方法，其特征在于：步骤3中，进行片段化的反应体系为：纯化的多重 PCR 扩增产物 30μL、NEBCutSmart Buffer 5μL、NEBNext dsDNA Fragmentase10U，用ddH₂O 加至50μL；片段化反应的条件为 37℃下处理1-1.5小时，得到酶切反应体系。

7.根据权利要求2所述的基于高通量测序的胃癌靶向治疗基因组文库的构建方法，其特征在于：步骤3中，末端修复的反应体系为：KAPA End Repair Enzyme Mix2-10μL、Nuclease-free water 20-40μL、5X KAPA End Repair Enzyme Buffer5 -20μL，90℃-95℃孵育30min。

8.根据权利要求2或6所述的基于高通量测序的胃癌靶向治疗基因组文库的构建方法，其特征在于：荧光PCR扩增产物或片段化产物均使用AgencourtAMPure XP 磁珠进行纯化，纯化体系为：向30-50μL的荧光PCR扩增产物或30-50μL的酶切反应体系中加入50-100μL的AgencourtAMPure XP 磁珠，然后置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清；移除上清液，加入 300-500μL的体积分数为80%的乙醇，180°旋转离心管使磁珠穿过溶液吸至另一侧管壁，旋转610次，静置后弃掉上清，将离心管自磁力架上取下，离心后置于磁力架上再次分离，移除残留的酒精溶液；将离心管自磁力架上取下，打开管盖，室温静置3~ 10 min，挥发残留乙醇。

9.根据权利要求2所述的基于高通量测序的胃癌靶向治疗基因组文库的构建方法，其特征在于：步骤3中，加A尾的反应体系为： KAPA A-Tailing Enzyme1-5μL、KAPA A-TailingEnzyme Buffer1-10μL、Nuclease-free water 20~ 60μL，在25℃-55℃孵育。