[发明专利]鉴别BT-CMS型水稻的引物、试剂盒及应用

说明书

本公开涉及用于鉴别包台型核质互作雄性不育系水稻的引物、试剂盒及其应用。该引物包括如SEQ ID NO.1所示的BT79‑F及如SEQ ID NO.2所示的BT79‑R；BT79‑F和BT79‑R用于扩增包台型核质互作雄性不育系水稻的线粒体嵌合基因Atp6‑orf79的特异性序列，所述扩增产物片段长度为521bp。利用该引物可快速鉴别包台型核质互作雄性不育系，有利于提高其种子纯度鉴定效率，以保障该品系繁种的安全性。

技术领域

本发明涉及水稻品系鉴别技术领域，尤其涉及鉴别BT-CMS型水稻的引物、试剂盒及应用。

背景技术

植物细胞质雄性不育(CMS)是广泛存在于自然界中的现象，主要表现为不能产生有功能的花粉从而导致不能正常受精结实的自然现象。水稻中细胞质雄性不育的品种来源很多，其中以野败型(简称WA-CMS)、红莲型(简称HL-CMS)和包台型(简称BT-CMS)为3种代表类型。在生产应用中，WA-CMS型不育系主要用于杂交籼稻中，BT-CMS型不育系主要用于杂交粳稻中，HL-CMS型不育系相对应用较少。

BT-CMS型不育系一般是通过常规粳稻转育而来，花时短，开花不集中，柱头外露率不高，导致了不育系的制繁种产量不高。而在水稻杂交种子生产过程中，高纯度的不育系是保障种子纯度最重要的因素。另外，由于BT-CMS型不育系与水稻保持系在株型、熟期等普通农艺性状基本一致，使用常规的田间表型鉴定的准确性低；而使用诸如SSR、Indel、STS等常规分子标记技术来鉴定品系纯度，无法有效区分BT-CMS型与保持系。

现有技术“段世华，郑卓，颜红宇等.HL-CMS基因orfH79在稻种资源中的遗传多态性研究[J]，江西农业大学学报，2015，37(1):27-33.”探讨了orf79在水稻资源中的遗传及变异，对来自不同稻作国家的124份水稻材料进行orfH79特异性PCR检测。有18份水稻材料检测出含有HL-CMS基因orfH79及其同源序列，结果表明HL-CMS基因orfH79及其同源序列在稻种资源中具较高频率的分布(14.5％)。DNA序列分析显示HL-CMS基因orfH79及其同源序列和BT-CMS基因orf79具有非常保守的遗传特性(97％)，共检测出6个多态性碱基位点，6个位点碱基的变异导致多肽ORFH79产生了5个位点氨基酸的变化。该文还根据水稻HL-CMS基因orf79编码区保守序列设计特异性PCR扩增引物对。

而且由于orf79为线粒体基因，在线粒体DNA由于裸露分散在线粒体基质中，不与组蛋白结合，更易于收到氧化物氧化而损伤或突变；通过一般手段提取的线粒体DNA，其中不免存在细胞核中存在的线粒体假基因的影响。而一般的组织DNA提取方法得到的DNA是细胞的总DNA混合物，其包括线粒体DNA、核DNA，也保护核中线粒体假基因。尽管常用的线粒体DNA提取方法能够得到大量的线粒体DNA，但是对于核中线粒体假基因的干扰，往往不能克服其带来的影响。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于至少提供一种能够鉴定BT-CMS型不育系或有效区分BT-CMS型不育系和保持系的分子生物学方法，以在无需单独提取水稻线粒体DNA时，有效地提高鉴定BT-CMS水稻的特异性和灵敏度。

第一方面，本发明公开了用于鉴别包台型核质互作雄性不育系水稻的引物，包括如SEQ ID NO.1所示的BT79-F及如SEQ ID NO.2所示的BT79-R；BT79-F和BT79-R用于扩增BT型核质互作雄性不育系水稻的线粒体嵌合基因Atp6-orf79的特异性序列，所述扩增产物片段长度为521bp。

在本发明的具体实施例中，所述线粒体嵌合基因Atp6-orf79全长1547bp，如SEQID NO.3所示，所述BT79-F针对的扩增起始位置为990bp，所述BT79-R针对的扩增起始位置为1469bp。

第二方面，本发明公开了鉴别包台型核质互作雄性不育系水稻的方法，包括以下步骤：

获取水稻幼苗的DNA样品；