[发明专利]NGF作为用于治疗食管癌的药物及诊断试剂盒的应用

权利要求书

1.NGF作为治疗食管癌药物或诊断食管癌的试剂盒。

2.NGF作为治疗食管癌药物或诊断食管癌的试剂盒的应用，其特征在于包括以下步骤；

a.以NGF作为目标调控基因，构建干扰NGF基因的表达载体；

步骤b：利用步骤a中的载体，进行体外细胞实验，食管癌细胞的增殖和迁移受到抑制；

步骤c：或者利用步骤a中的载体，进行Western Blot分析，AKT的磷酸化水平受到抑制；

步骤d：或者.利用步骤a中的载体，进行荧光定量PCR分析，NGF基因表达水平显著下调，并且抑制与增殖和迁移相关的Cyclin D1及MMP2基因的表达水平。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述步骤a中，干扰NGF基因的表达载体为RNAi系统基因沉默载体，干扰NGF表达包括沉默NGF编码基因，降低或抑制其转录为mRNA和翻译为蛋白质的功能。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述步骤b-d中，均需进行细胞转染处理，所述细胞转染试剂为Lipofectamine 2000，转染后作用时间为24小时。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述步骤b中，细胞增殖实验为MTT实验，MTT的作用时间为4小时，检测波长为450nm。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述步骤b中，细胞迁移实验为细胞划痕实验。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述步骤c中，所用一抗为P-AKT、AKT以及β-actin，其中P-AKT及AKT所用二抗为IgG羊抗兔，β-actin所用二抗为IgG羊抗鼠。

8.如权利要求1所述的NGF作为治疗食管癌药物和诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述步骤d中，荧光定量PCR分析中用SYBR Green I荧光染料法来定量mRNA的相对表达水平，以cDNA为模板，β-actin作为内参基因进行标准化校正；所述荧光定量PCR程序为：50℃2min；95℃10min，95℃1s，60℃1min，重复40个循环。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：模板cDNA是通过对食管癌细胞进行转染处理，24小时后使用Trizol试剂提取细胞总RNA，随后利用Invitrogen反转录试剂盒进行逆转录得到。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：β-actin的正向引物为：CCCTGGCACCCAGCAC，反向引物为：TGTCCGAATGTAGTGCTCCAC；NGF的正向引物为：TGTGGGTTGGGGATAAGACCA，反向引物为：GCTGTCAACGGGATTTGGGT；Cyclin D1的正向引物为：GATCAAGTGTGACCCGGAC，反向引物为CTTGGGGTCCATGTTCTGCT；MMP2的正向引物为GGACTTAGACCGCTTGGCTT，反向引物为：GTGTTCAGGTATTGCATGTGCT。