[发明专利]一种重组人XVII型胶原蛋白、制备方法和应用

说明书

本发明提供一种重组人XVII型胶原蛋白，所述胶原蛋白，由(A)n所示的氨基酸序列组成或包含(A)n所示的氨基酸序列，其中A为SEQ ID NO.2所示序列或在SEQ ID NO.2基础上进行一定程度上氨基酸修改后的序列或与SEQ ID NO.2具有大于80％同源性的序列；其中n为大于或等于1的整数；其中每个A相同或不同并且以A为基础单元串联重复，每个相同或不同的A之间直接通过肽键相连接。本发明中验证了该胶原蛋白不但能够实现人XVII型胶原蛋白于毕赤酵母这种真核宿主细胞的高效分泌可溶性表达，而且还具有比商品化的天然人胶原蛋白更为优异的细胞粘附活性、促细胞迁移活性以及优异组织再生和促进毛囊修复再生的生物学活性，并且可工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种重组人XVII型胶原蛋白、制备方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

胶原蛋白作为重要的天然生物蛋白，可广泛应用于化工、医药、食品、化妆品等众多领域，尤其适合制备多种生物器械，是最为理想的生物材料来源，具有广阔的应用前景。市场上销售胶原蛋白主要是利用酸、碱、酶解法处理动物组织获得的胶原提取物。这类提取物在加工过程中，基本破坏了胶原的天然结构，降解严重，使其生物活性丧失；提取的胶原肽长度不等、性质不均、质量不稳定且有病毒感染的风险；同时动物源与人的胶原蛋白的氨基酸序列差别较大，会导致免疫排斥和过敏症状。

人XVII型胶原蛋白是一种跨膜型非成纤维胶原蛋白，其为三条相同α1(XVII)链构成的均相三聚体，分为胞内、跨膜、胞外三大类结构域。人XVII型胶原蛋白是细胞中半桥粒的一种组成成分，在上皮细胞-基底膜的作用中发挥重要作用，可调控上皮细胞的黏附、分离和发育分化，对角化细胞的分化和再生有重要作用。人XVII型胶原蛋白在人体中含量极少，且XVII型胶原蛋白在动物体内含量同样极为稀少，提取难度也非常大，无法量产，同时动物源性胶原蛋白产品不可避免的有免疫原性和潜在的病毒、疫病等生物安全性隐患，没有大量应用。限于法理伦理的约束，人源XVII型胶原蛋白只能应用于科研层面，这些也就导致现在市场上没有人或其它动物来源的商品化XVII型胶原蛋白产品，这也进一步限制了人XVII型胶原蛋白的研究和应用。现在解决此类问题的主要方式则是通过基因工程等生物技术来完成胶原蛋白。

现有重组蛋白主要由原核(大肠杆菌)表达系统，毕赤酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞(杆状病毒)表达系统四大类表达系统进行生产。关于哺乳动物细胞表达人XVII型胶原蛋白的研究较少，且均处于实验研究阶段；最早使用原核表达(大肠杆菌、pGEX表达载体)的是非螺旋区NC16序列的融合蛋白，其余表达系统暂无成功表达人XVII型胶原蛋白的报道，尤其是毕赤酵母表达系统。

其中哺乳动物细胞表达成本高、产量低，多用于高价值的药用蛋白表达生产。哺乳动物细胞表达的人XVII型胶原蛋白，无论是瞬时转染表达还是稳定转染细胞系表达，蛋白质表达量极低，同时其所使用的培养基昂贵，只能满足科学研究中微量的使用。昆虫细胞(杆状病毒)表达系统除成本高、成量低外，其翻译后与人细胞差异巨大，胶原蛋白的大量生产应用一般不采用这两种方式。原核表达(大肠杆菌表达系统)的胶原蛋白没有对蛋白质的翻译后修饰，有大规模放大前景的原核表达只能是胞内表达，需要进行菌体的裂解，会有大量杂质蛋白与目的蛋白混合，对纯化工艺都有极高的要求，且原核表达体系天然带有(细菌细胞壁成分)内毒素、肽聚糖，需要复杂的纯化工艺方能去除。

以上的几个表达系统中，均存在序列的单一性与生物学活性的问题，序列选取比较单一、胶原蛋白肽均是分别独立进行表达等，相对于人XVII型胶原蛋白胞外域接近1000个氨基酸(分15个三螺旋区、15个非三螺旋区)的序列丰富性而言，这两者是欠缺的，这也直接影响了生物学活性，胶原的生物学活性中细胞粘附活性只是最基础的一项，其余的生物学活性均未涉及。并且，无论是以上的哺乳动物细胞表达，还是大肠杆菌表达，均只停留于小体积实验室级别的培养、生产，均没有进行规划化生产。但重组胶原蛋白的应用前提是能够进行规模化、高密度、高表达的发酵生产和纯化，一般来经过说500L体积的中试发酵实验的验证方有工业级别、规模化放大生产的可能性。