[发明专利]检测RXR/PPAR二聚体干扰物的转录激活系统及方法

说明书

检测RXR/PPAR二聚体干扰物的转录激活系统及方法，包括将栉孔扇贝维甲酸受体基因RXRa连接到载体pGBT9上，构建酵母表达质粒pGBT9‑RXRa；将栉孔扇贝过氧化物酶体增殖剂激活受体PPARα连接到载体pGADT7上，构建酵母表达质粒pGADT7‑PPARα。将pGBT9‑RXRa及pGADT7‑PPARα共转化入Y187酵母细胞构建RXRa/PPARα二聚体转录激活系统，筛选培养阳性克隆。以酿酒酵母Y187作为宿主菌株，简化了报告质粒的构建，提高该检测方法的灵敏度与准确性，降低了假阳性发生的概率。本发明大大提高了鉴定或检测具有干扰RXR/PPAR二聚体的内分泌干扰活性化学品的特异性。

技术领域

本发明涉及一种检测RXR/PPAR二聚体干扰物的转录激活系统及方法，具体是通过构建重组质粒获得包含RXR和PPAR的酵母转录激活系统，以及利用此系统检测环境中潜在内分泌干扰物的方法。

背景技术

维甲酸X受体(RXR)作为配体依赖性的转录因子，既可以与其自身形成同二聚体，也可与其他核受体如过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)、维甲酸受体(RAR)和甲状腺激素受体(TR)形成异二聚体，因此是核受体超家族信号通路中的关键参与者。RXR的转录机制与经典核受体机制相同，即RXR二聚体与靶基因启动子区域的反应元件结合，在辅激活因子的协助下调控下游靶基因的转录表达，从而调控相应的生理学过程。

作为典型的RXR干扰物，有机锡化合物在海洋环境中的扩散以及在沉积物中的累积可能通过干扰RXR信号通路进而诱导腹足类、双壳类、甲壳类以及鱼类等众多海洋生物产生严重的内分泌干扰效应，如生殖代谢紊乱、免疫失调与生长代谢紊乱等。过去研究发现脊椎动物中三丁基氯化锡TBT与RXR结合，可能进一步干扰RXR/PPAR异二聚体信号通路，进而放大对生物的毒理学效应。

在体外筛选内分泌干扰物(EDCs)的方法中，转录激活实验应用较为广泛，其他几种体外测试的应用均受到较大限制，受体结合实验易产生放射污染，细胞增殖实验和卵黄蛋白原方法均用于测试具有雌激素效应的EDCs，应用范围受到限制。基于酵母细胞或哺乳动物细胞的转录激活系统是检测化学品以及预测对暴露生物体影响的有用工具。哺乳动物细胞的内部环境如启动子、多种转录因子的存在使得以其作为宿主细胞的报告基因实验极易出现假阳性，对实验结果造成严重的干扰。基于酵母细胞的生物测试可以避免哺乳动物细胞表达系统中存在的内源性受体或互作因子的背景，操作简便且易重复。

广泛应用于蛋白互作的酵母双杂交系统往往需要数天才能完成底物比色，并且用于检测酵母双杂交系统表达的报告基因需与目的基因连接后转入酵母菌种，从而启动报告基因的表达，无法排除报告基因对酵母双杂交系统的影响，已有研究人员依据酵母双杂交GAL4因子的原理构建体外检测系统评估有机锡等污染物与RXR的结合能力，但目前对EDCs干扰RXR二聚体方面的研究则是空白。

发明内容

本发明的目的在于构建一种检测环境中RXR/PPAR二聚体干扰物的酵母转录激活系统及方法，能够较为灵敏的检测具有干扰RXR/PPAR相互作用活性的化合物，操作简便，以克服现有技术的缺点与不足。

本发明通过以下技术方案实现：

一种检测环境中RXR/PPAR二聚体干扰物的酵母转录激活系统，该系统中含有pGBT9-RXRa酵母表达质粒和pGADT7-PPARα酵母表达质粒，所用宿主细胞为酿酒酵母Y187菌株。

两种酵母表达质粒所用载体为pGBT9与pGADT7；其中，pGBT9载体含有GAL4因子的DNA结合结构域(DNA-BD)以及营养缺陷型筛选标记Trp，pGADT7载体含有GAL4因子的激活结构域(AD)以及营养缺陷型筛选标记Leu。

其中，所述的pGBT9-RXRa酵母表达质粒包含序列为SEQ ID No.1的栉孔扇贝维甲酸X受体基因RXRa，所述的pGADT7-PPARα酵母表达质粒包含序列为SEQ ID No.2的栉孔扇贝过氧化物酶体增殖剂激活受体基因PPARα。