[发明专利]一种普卡那肽的合成方法

说明书

本发明公开了一种普卡那肽的合成方法。该方法包括在活化剂的存在下，由树脂固相载体和Fmoc‑Leu‑OH偶联得到Fmoc‑Leu‑树脂，通过固相合成法，按照普卡那肽主链肽顺序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，偶联完之后裂解，使得普卡那肽从树脂上脱除并脱除掉全部侧链保护基团，裂解之后冻干得到普卡那肽线性粗肽；将所得的普卡那肽线性粗肽溶于溶剂中得到溶解液，溶解液中溶质/溶剂的质量体积比为0.1‑1.0mg/mL，然后进行环化，分离纯化得到环化好的普卡那肽，冻干得到精肽。该方法简单，产率高，错配率低。

技术领域

本发明涉及化学合成领域，尤其涉及一种普卡那肽的合成方法。

背景技术

目前普卡合成方法常规有二：一是先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上，利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对Cys不同位置的保护基，直完成两个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来进行纯化。但是用酶促反应将片段偶联至固相树脂，产率低，不适用于工业生产；选择性去除Cys上特殊保护基团较为困难，条件苛刻；且在固相树脂上进行第一对二硫键环化方法复杂，得率低。二是在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Leu-OH偶联得到Fmoc-Leu-树脂，通过固相合成法，按照普卡那肽主链肽顺序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，按照普卡那肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联，合成完毕之后进行裂解，在水溶液或者DMSO溶液中进行液相环化，最后纯化，冻干后得到普卡那肽；但是在高氧化能力下，二硫键错配程度高，导致最终纯化困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单，产率高，错配率低的普卡那肽的合成方法。

为实现上述目的，本发明提供一种普卡那肽的合成方法，其特征在于，合成步骤包括：

获取线性肽：在活化剂的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Leu-OH偶联得到Fmoc-Leu-树脂，通过固相合成法，按照普卡那肽主链肽顺序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，偶联完之后裂解，使得普卡那肽从树脂上脱除并脱除掉全部侧链保护基团，裂解之后冻干得到普卡那肽线性粗肽；

环化步骤：将所得的普卡那肽线性粗肽溶于溶剂中得到溶解液，溶解液中溶质/溶剂的质量体积比为0.1-1.0mg/mL，然后进行环化，所述环化所用的环化液为0.1-1M NaCl、0.1-1M Tris-HCl、5-10mM GSH和0.5-1mM GSSG和0.1-0.5mM盐酸胍，pH值为7.5；

纯化：分离纯化得到环化好的普卡那肽，冻干得到精肽。

进一步，所述溶剂为水或者有机溶剂。

进一步，所述有机溶剂为乙腈。

进一步，所述环化步骤中的环化为将溶解液缓慢滴入到环化液中密封，黑暗下0-6℃放置12-24h。

进一步，所述环化步骤中的环化为黑暗下0-6℃放置20-24h。

进一步，所述环化步骤中的环化通过加入50％TFA终止反应。

进一步，所述普卡那肽线性粗肽与环化液的用量比为5mg：50mL。

所述环化液为0.1-1M NaCl、0.1-1M Tris-HCl、5-10mM GSH和0.5-1mM GSSG和0.1-0.5mM盐酸胍，pH值为7.5。0.1-1M NaCl是用于保证环化液的离子平衡，Tris-HCl是缓冲体系，与NaCl一起保证溶液内离子平衡和酸碱度不变，5-10mM GSH和0.5-1mM GSSG是用于氧化形成2硫键的关键，盐酸胍的作用是破坏形成好的二硫键，整个环化过程在PH7.5的缓冲体系下，GSH与GSSH的氧化还原对不断形成，盐酸胍不断破环，最终形成最稳定的二硫键构象，GSH浓度是GSSH的5倍过量，可使形成2硫键的速度大于盐酸胍破环速度，可使得最终反应完之后都是已环化的产品。