[发明专利]牛体外受精胚胎培养和冻存的方法

权利要求书

1.牛体外受精胚胎培养和冻存的方法，其包括如下步骤：

将成熟的卵丘-卵母细胞复合体在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；

从液氮中取一支冻精细管，37℃水浴解冻；无菌操作剪开细管两端，使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中，328×g离心2次，每次5min，离心后弃上清；将300µL精液制备培养液加入上述离心管，重悬精子沉淀，取适当的精子悬液进行精子计数；

将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中，并将培养盘放入培养箱，使精卵共孵育16-20h，培养条件为38.8℃、5.5-6.5% CO₂、饱和湿度，完成体外受精操作；

体外受精操作完毕后，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入胚胎培养液中培养，此时记为胚胎培养的第1天，培养条件为38.8℃、6% O₂、88% N₂、饱和湿度，第3天记录卵裂率；第7天记录囊胚率，至第9天时统计囊胚孵化率，并进行质量鉴定；

将可用胚胎在保存液中洗涤3次，在平衡液中平衡10min后转移入冷冻液，按5段装液法装入胚胎，做好标记，再放入程序降温仪中按照0.5℃/min的速度降至-35℃后，将胚胎细管迅速取出，置入液氮中冷冻保存；

在需要使用冷冻保存的胚胎时，从液氮中取出细管，在空气中停留5s，放入37°C水浴中，待冰晶全部融化为止，剪开细管，将胚胎迅速移入解冻液中，室温下保持5min，然后将胚胎放入胚胎培养液小滴内培养，完成解冻过程；

其中，

所述受精培养液是包含112.0mM 氯化钠、4.02mM 氯化钾、2.25mM的氯化钙二水合物、0.52mM六水氯化镁、0.83mM磷酸二氢钾、37.0mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10umoL/L α-硫辛酸、25μg/ml叶酸、3mg/ml谷氨酸钠的水溶液，

所述精液制备培养液是包含112.0mM 氯化钠、4.02mM 氯化钾、2.25mM的 氯化钙二水合物、0.52mM六水氯化镁、0.83mM磷酸二氢钾、37.0mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白、10mM咖啡因、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10umoL/L α-硫辛酸、25μg/ml叶酸、3mg/ml谷氨酸钠的水溶液，

所述冷冻液的组成为：PBS+20%FBS+1.8mol/L乙二醇+0.25mol/L蔗糖+0.2%右旋糖酐40+5mmol/L乙酰半胱氨酸，

所述解冻液的组成为：PBS+20%FBS+0.25mol/L蔗糖+0.2%右旋糖酐40+5mmol/L乙酰半胱氨酸。

2.根据权利要求1的方法，其中所述卵丘-卵母细胞复合体是通过如下方法采集和体外成熟的：

a)离体采集：取屠宰场所得牛卵巢，抽取表面2-8mm的卵泡，收集沉淀，在体视显微镜下捡出至少含有3层卵丘细胞包裹的卵母细胞COCs即卵丘-卵母细胞复合体，放入包含HEPES的运输培养液中38.8℃、无二氧化碳供应、24h内运回实验室；

b)将以上离体采集所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，再转移到新的成熟培养液中培养22-24h，培养条件为38.8℃、5.5-6.5% CO₂、饱和湿度，得到成熟的卵丘-卵母细胞复合体。