[发明专利]一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器及其制备与应用

说明书

本发明公开了一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器及其制备与应用，其检测方法为：(1)外泌体的提取：从肝癌细胞中提取外泌体；(2)金纳米‑酪胺复合物的合成：先合成金纳米粒子，然后将金纳米粒子与酪胺结合生成金纳米‑酪胺复合物；(3)SPRi检测：先在芯片表面修饰带有G4链的适体发夹捕获探针，然后上样外泌体，外泌体上样后，适体与外泌体表面的蛋白特异性结合，将发夹打开，释放出G4序列，形成G4‑hemin酶，最后上样金纳米‑酪胺复合物，通过酪胺信号扩增(TSA)将金纳米粒子结合到芯片表面，通过SPR进行检测。本传感器是一种免标记、能实时检测肝癌细胞源性外泌体的SPRi生物传感器，灵敏度和特异性高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器及其制备与应用。

背景技术

肝癌发病率位居我国恶性肿瘤第三，患病风险高，死亡率高。提高肝癌患者生存率最有效的方法是早期诊断和治疗。得益于操作简便，无创，可随时取样检测且反应迅速，液体活检被认为是用于肿瘤早期筛查的最有前景的方法之一。其中，生物标志物的选择是确定液体活检结果可靠性的关键。外泌体是近年来新兴的肿瘤标志物之一，它是哺乳动物细胞分泌的粒径为30-200nm的双层膜盘状囊泡。大量研究表明，外泌体的产生，内容物和功能在肿瘤的发生发展进程中有不可忽视的作用。而且，发生癌变后的细胞分泌的外泌体量远远超过正常生理状态下的细胞，甚至癌症细胞源性的外泌体膜上会带有特异性的肿瘤标记物，因此，我们可以通过研究分析外泌体来监测癌症的发生发展。

目前，应用较为广泛的几种外泌体检测方法主要包括荧光，流式细胞术(FCM)，纳米粒子跟踪分析(NTA)和表面等离子共振成像技术(SPRi)等。其中，SPRi因其独特的实时成像，免标记，高通量等特点，可以通过实时捕获折射率的变化来监测芯片上发生的生物分子间结合或解离反应，成功吸引了广大研究者们的注意。SPRi检测中，在金芯片表面修饰的DNA探针或抗体可以通过特定的化学键捕获目标物质从而形成质量增加的聚合物，与此同时，通过电荷耦合检测器(CCD)检测到由结合过程引起的折射率变化并实时成像。由于SPRi检测的敏感区域局限于距离芯片表面200nm以内，因此粒径小于200nm的外泌体囊泡与这项技术的检测要求十分契合。另外，在光学检测平台中，SPRi的信号输出性能比其他检测方法更稳定，具有更好的光稳定性。

得益于上述SPRi检测技术的多种优势，研究人员成功地运用了多种策略来检测生物分子，例如DNA、RNA和蛋白质等。然而，该方法仍然存在其固有缺陷，当用于检测复杂样品中的痕量目标物质时，灵敏度有待提高。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器及其制备与应用，本传感器是基于G4-hemin和酪胺信号扩增(TSA)的免标记实时SPRi生物传感器，通过将G4-hemin出色的催化性能与酪胺信号扩增相结合，使大量金纳米粒子结合到外泌体表面，极大的扩增SPR检测信号，以提高肝癌外泌体检测的灵敏度。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)外泌体的提取：从肝癌细胞中提取外泌体；

(2)金纳米-酪胺复合物的合成：先合成金纳米粒子，然后将金纳米粒子与酪胺结合生成金纳米-酪胺复合物(AuNPs-Ty复合物)；

(3)SPRi生物传感器的制备：先在芯片表面修饰带有G4链的适体发夹捕获探针，然后上样外泌体，外泌体上样后，适体与外泌体表面的蛋白特异性结合，将发夹打开，释放出G4序列，形成G4-hemin酶，最后上样金纳米-酪胺复合物，通过酪胺信号扩增(TSA)将金纳米粒子结合到芯片表面，制得所述SPRi生物传感器。

进一步，所述SPRi生物传感器通过CCD探测器捕获由于芯片表面发生的生物分子间的结合而出现的折射率改变来检测肝癌外泌体。