[发明专利]一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器及其制备与应用

权利要求书

1.一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)外泌体的提取：从肝癌细胞中提取外泌体；

(2)金纳米-酪胺复合物的合成：先合成金纳米粒子，然后将金纳米粒子与酪胺结合生成金纳米-酪胺复合物；

(3)SPRi生物传感器的制备：先在芯片表面修饰带有G4链的适体发夹捕获探针，然后上样外泌体，外泌体上样后，适体与外泌体表面的蛋白特异性结合，将发夹打开，释放出G4序列，形成G4-hemin酶，最后上样金纳米-酪胺复合物，通过酪胺信号扩增将金纳米粒子结合到芯片表面，制得所述SPRi生物传感器。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述SPRi生物传感器通过CCD探测器捕获由于芯片表面发生的生物分子间的结合而出现的折射率改变来检测肝癌外泌体；

和/或，步骤(1)中，从肝癌细胞中提取外泌体的方法为超速离心法；

和/或，步骤(1)中，所述肝癌细胞选自HepG2细胞、MHCC-97细胞、HUH-7细胞、SMMC-7721细胞、Bel-7402细胞、Hep-3B细胞中的至少一种；

和/或，步骤(2)中，所述金纳米粒子的粒径为12-16nm；

和/或，步骤(2)中，金纳米-酪胺复合物的合成包括如下步骤：

(2a)合成金纳米粒子：将还原剂加入到煮沸的HAuCl₄·4H₂O溶液中，溶液颜色由浅黄色变为深红色，保持继续煮沸10-15分钟后关闭加热，将溶液避光搅拌冷却到室温，得到AuNPs溶液；

(2b)溶解酪胺：将酪胺盐酸盐溶解于水中，制得酪胺溶液；

(2c)合成金纳米-酪胺复合物：先将同时含有巯基和羧基的交联试剂加入到AuNPs溶液中，搅拌反应，AuNPs通过巯基与交联试剂结合，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺、N-(3-(二甲基氨基)丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基，再加入酪胺溶液，通过氨基-羧基反应将酪胺与交联试剂结合，最终生成金纳米-酪胺复合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2a)中，所述还原剂与HAuCl₄·4H₂O溶液的摩尔用量比为3.8-4.0∶1；

和/或，步骤(2a)中，所述还原剂选自柠檬酸钠、硼氢化钠中的至少一种；

和/或，步骤(2c)中，所述交联试剂、AuNPs、酪胺的摩尔用量比为(5×10^-4～6×10^-4)∶1∶(2×10^-4～3×10^-4)；

和/或，步骤(2c)中，所述交联试剂选自11-巯基十一烷酸(MUA)、生物素-亲和素中的至少一种；

和/或，步骤(2c)中，所述N-羟基琥珀酰亚胺、N-(3-(二甲基氨基)丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐和酪胺的用量比为(1-2)∶(2-3)∶0.1(mg/mg/mol)；

和/或，步骤(2c)中，反应时间均为10-15小时。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述芯片为金传感器芯片；

和/或，步骤(3)中，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

和/或，步骤(3)中，SPRi生物传感器的制备方法包括如下步骤：

(3a)首先，依次用丙酮、乙醇和去离子水清洗芯片，氮气吹干，用食人鱼溶液覆盖于芯片表面，再用去离子水洗涤并在氮气下干燥；然后用固定液稀释发夹捕获探针，通过金-硫键修饰于芯片上，并依次进行封闭；

(3b)先上样外泌体，将发夹打开，释放出G4序列，形成G4-hemin酶，最后上样金纳米-酪胺复合物，通过G4-hemin酶催化酪胺，将大量金纳米粒子结合到外泌体表面，制得所述SPRi生物传感器。