[发明专利]一种鉴别猪伪狂犬病毒基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

本发明涉及动物病疫检测领域，具体涉及一种鉴别猪伪狂犬病毒基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量PCR检测试剂盒。在本发明提供的检测试剂盒中，用于检测猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失情况的引物及探针如SEQ ID NO.1‑3所示。本发明提供的检测试剂盒中还包括，基于化学法修饰的热启动DNA聚合酶、dUTP/UNG防污染系统、抗PCR抑制物因子。本发明提供的检测试剂盒敏感性高，最低检测限为189copies/uL。本发明所述试剂盒适用于复杂的动物临床样本的检测。

技术领域

本发明涉及动物病疫检测领域，具体涉及一种鉴别PRV的gI/gE基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量检测试剂盒。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies,PR或Aujeszky’s disease,AD)是一种由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的多种家畜和野生动物共患的急性、热性传染病。伪狂犬病毒能引起猪发生亚临床感染和潜伏感染，但临床症状因日龄不同而异，仔猪常表现高热，食欲废绝，流涎，呼吸困难，震颤和腹泻等症状，继而出现运动失调，间歇性抽搐，昏迷直至死亡(15日龄以内仔猪死亡率常高达100％，断奶仔猪死亡率为10％～20％)；育肥猪仅表现轻微的呼吸道症状，增重减缓等；母猪表现返情，屡配不孕，妊娠母猪常表现流产，产死胎和木乃伊；公猪则常出现睾丸肿胀，萎缩等，种用性能降低或丧失。

PRV是一种抵抗力较强的疱疹病毒，有多种蛋白质，在这些蛋白质中，包膜成分蛋白质gB,gC诱导细胞和体液免疫应答，gE蛋白是一个主要的毒力蛋白，能够促进感染细胞和未感染细胞的融合，是病毒入侵中枢神经的必需致病因子。由于gE基因缺失的弱毒疫苗比单独缺失其他基因的PRV疫苗更为安全，所以目前欧盟和美国都规定只准使用gE基因缺失的疫苗。目前所知1200多个伪狂犬病野生毒株，全部含有gE基因，所以gE蛋白抗体有无是鉴别野毒和疫苗株的重要依据。目前认为，gE和gI蛋白共同形成一个非共价结合的复合体，该复合体存在于被感染的细胞膜和病毒囊膜中，该复合体对于PRV在神经系统的侵袭和传播起到一定的作用，但是，gE和gI蛋白没有共同的抗原决定簇。

实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。与常规PCR相比该技术可快速、灵敏的检测病毒RNA和DNA以及细菌DNA。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别区分PRV的gI/gE基因缺失株与野毒株的方法。尤其是，提供一种鉴别区分PRV野毒株与HB98和HB2000基因缺失株的方法。

科前公司的HB98和HB2000为PRV的gI和gE基因部分缺失的疫苗，市面已有的荧光定量检测试剂盒不能检测区分科前生物股份有限公司的HB98和HB2000(gI和gE基因缺失)疫苗株，可能原因是这两个疫苗株缺失的核苷酸序列相对较少，且病毒变异的风险客观存在。本发明利用自主设计的引物和探针建立了猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的鉴定、检测方法。

为了准确、规范、快速、高效的对猪场进行伪狂犬病毒野毒和gI/gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断，本发明提供基于TaqMan的实时荧光定量PCR(qPCR)提供对猪伪狂犬病毒野毒病原和gI/gE基因缺失疫苗株进行区分的方法。

为了实现本发明的目的，第一方面，本发明提供荧光定量PCR检测鉴别猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失疫苗株和野毒株的引物和探针，其中，用于鉴别gI/gE基因缺失的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；用于鉴别gI/gE基因缺失的TaqMan探针核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

具体地，本发明提供的引物和探针，主要适用于鉴别猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失疫苗株HB98和HB2000，本发明所提供的引物扩增所得片段位于gI和gE基因的连接处。