[发明专利]一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法

权利要求书

1.一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将获取的脂肪组织清洗后剪碎，加入1～2倍体积的消化酶进行消化；

2)第一次消化结束后对步骤1)所得的组织悬液进行离心，抽取下层消化液和细胞的混悬液，加入等体积的终止液中和消化酶的作用，得到悬液A，上层未消化的组织块继续加入1～2倍体积的消化酶对组织块进行第二次的消化；

3)在第二次消化后，将未完全消化的组织块，第二次消化所得的消化液和细胞的混悬液，以及悬液A，全部加入放置了细胞筛网的培养皿中，进行手工柔和研磨，吸取研磨后的细胞悬液，加入等体积的终止液中和消化酶的作用，得到悬液B；

4)为提高细胞得率，用平衡液多次轻柔冲洗研磨后的细胞筛网，冲洗后的液体加入悬液B，得到悬液C；

5)将悬液C离心后得到的细胞团块使用平衡液重悬，过细胞筛网，得到的悬液D，即为所需细胞悬液。

6)将步骤5)所得的细胞悬液通过流式分选出所需单细胞，用于后续检测及实验。

2.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，步骤1)～3)中的消化酶为DMEM或PBS配制的，质量体积分数为0.1％的胶原酶I。

3.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，步骤1)～2)消化条件为37℃，每次消化时间为15分钟。

4.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，步骤2)中的离心为短时低速离心，优选的，所述的离心速度为300g，离心时间为3分钟。

5.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，步骤2)～3)中使用的终止液是在DMEM中添加了体积分数为10％的胎牛血清。

6.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，步骤3)～4)中使用的细胞筛网为70um或100um孔径的细胞筛网。

7.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，步骤5)中使用的细胞筛网为40um或70um孔径的细胞筛网。

8.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，步骤6)中使用的流式分选策略为：

1)上机前10分钟在细胞悬液中加入死细胞染料DAPI；

2)第一步根据FSC及SSC，框选出合适细胞群，去除黏连的细胞；第二步框选出DAPI阴性，即为活细胞，分选出DAPI阴性的细胞。

9.如权利要求1-8任一所述的一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，所述方法用于获取脂肪组织中的单细胞，优选地，获取脂肪组织中的免疫细胞和/或干细胞。

10.如权利要求1-8任一所述的一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，所述脂肪组织为心包脂肪，血管旁脂肪，或眼周脂肪。