[发明专利]一种猪毛乳头细胞的培养方法

说明书

本发明涉及一种猪毛乳头细胞的培养方法，所述猪毛乳头细胞取自猪耳皮肤组织，采用Ⅰ型胶原酶、胰酶进行消化分离，采用胎牛血清培养基加入鼠尾胶原进行细胞培养。采用本发明提供的方法，表皮与真皮结构易于区分，毛囊结构清晰分明，易于分离，缩短了细胞传代时间13小时左右，并且贴壁更牢。本发明提供的方法可以使猪毛乳头细胞在7代以内保持毛乳头细胞特性且纯度高，因此可批量获得高纯度且传代一致性较好的猪毛乳头细胞。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪毛乳头细胞的培养方法。

背景技术

毛囊是皮肤最为重要的附属器官，其发育涉及外胚层和中胚层的相互作用。毛囊的周期性循环再生长(生长期、退化期和静止期的周期性循环)的特性导致新毛发的生长与旧毛发的脱落。当毛囊的周期性再生功能发生异常时，会导致脱发、多毛症和毛干疾病等毛囊疾病。随着社会的发展，人们对影响生活与工作的毛发越来越重视，对毛囊周期性发育的研究变得越来越重要。

目前，对于脱发问题有效的解决方法是进行毛发移植手术，由于毛发移植是对原有毛囊的重新分配和布局，并没有产生新的毛囊，所以不适于较大面积毛发缺失的治疗。如果能够诱导出新的毛囊，尤其能够在体外构建出毛囊的话，那么这一问题将迎刃而解。其中，毛乳头是毛囊的重要组成部分，在毛囊的形成、发育和毛囊周期的调控当中是不可或缺的，其分泌的多种细胞因子、生长因子可通过异种移植等手段，在体外条件下进行诱导毛囊的重建过程。因此，在体外对毛乳头细胞进行培养对研究脱发问题具有重要意义。

在人类毛囊问题的研究上，最理想的材料为人毛乳头细胞。但人毛乳头细胞来源有限，制约其进一步研究。羊和兔的毛囊发育涉及到初级毛囊和次级毛囊的发育，与人类毛囊发育存在区别，并不适用。猪的毛囊发育不涉及到次级毛囊的发育，且相较于小鼠，猪的毛囊形成阶段与人类类似，约处于妊娠周期的前三分之一时期。同时，猪的皮肤在解剖学、组织学和生理学上与人类皮肤接近，是理想的毛囊研究模式动物。相较于背部皮肤，猪耳部皮肤较薄，易于后续组织消化，耳部皮肤比较适合毛乳头细胞的分离与培养。

毛乳头细胞的体外培养是深入研究毛囊生物学、真表皮相互作用机制、毛发形成-重建过程、临床各种与毛发相关的功能代谢失调疾病的关键环节和基础。要获得毛乳头细胞，首先得分离出完整的毛囊结构。毛囊由包在毛根外的上皮组织和结缔组织鞘构成。毛乳头细胞位于毛囊的底部毛球中，被一层很厚的基底膜包绕，体积小，分离困难。由于毛乳头解剖位置特别，生物学特征明显，贴壁困难等，高纯度的毛乳头细胞较难获得，制约了毛囊生物学的研究进展。

毛乳头细胞的传统分离方法为采用显微切割的方式，但此方法劳动强度大、易使操作者疲劳、增大细菌污染几率且获得的细胞数量较少，而且分离出的毛乳头细胞被基底膜包被而难以贴壁且迁出速度慢。现在常用的酶消化法可以批量获得毛乳头细胞，但由于毛囊周期发育模式和不同部位皮肤厚度的差异等，使得在不同物种的不同部位对毛乳头细胞进行提取和培养的方法存在显著差异，而且采用不同培养条件，会影响毛乳头细胞的传代时间。目前已经建立的毛乳头细胞培养方法，主要是针对毛用动物的，而毛用动物的毛乳头与人类差异巨大，并不适用于人类毛囊科学的研究需求，而针对猪的毛乳头细胞培养方法还未真正建立，并不能批量提供高纯度的毛乳头细胞以供研究，因此，亟需提供一种适合猪耳组织进行纯度高的毛乳头细胞的提取和培养方法，为进一步分析和研究人类毛囊疾病奠定基础。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种猪毛乳头细胞的培养方法，旨在批量获得高纯度的猪毛乳头细胞。

本发明提供的一种猪毛乳头细胞的培养方法，所述猪毛乳头细胞取自猪耳皮肤组织，所述猪耳皮肤组织来自屠宰后半小时内猪只耳朵较薄部位的皮肤组织，所剪取的耳样大小要在不卷曲的情况下可置于离心管中，并用生理盐水浸没，8-10小时内完成猪毛乳头细胞分离培养操作；

有关毛乳头细胞的培养方法具体包括如下步骤：所述猪毛乳头细胞取自上述耳样，具体包括如下步骤：