[发明专利]一种猪毛乳头细胞的培养方法

权利要求书

1.一种猪毛乳头细胞的培养方法，其特征在于，所述猪毛乳头细胞取自猪耳皮肤组织，所述猪耳皮肤组织来自屠宰后半小时内猪只耳朵较薄部位的皮肤组织，在不卷曲的情况下置于离心管中，并用生理盐水浸没，8-10小时内完成猪毛乳头细胞分离培养操作；

有关毛乳头细胞的培养方法具体包括如下步骤：所述猪毛乳头细胞取自上述耳样，具体包括如下步骤：

S1、将耳样从生理盐水中取出，将耳样皮肤剪成1.5cm*4cm状长条，在生理盐水中清洗，刮去表面脏物，随后放到碘伏溶液中清洗2min；

再放到生理盐水中清洗，然后放到75%酒精溶液中进行清洗2min；

再一次将耳样放到生理盐水中清洗，然后放到PBS中进行清洗2min，最后放到生理盐水中清洗干净；

S2、将S1处理好的耳样边缘部分剪掉弃之，先去掉表皮长毛的部分，再去掉表皮层和软骨，将剩余组织剪成米粒大小的组织颗粒；

S3、将S2获得的组织颗粒置于离心管中，加入Ⅰ型胶原酶，使其浸没上述组织颗粒，37℃消化4-5h，每间隔10-15min吹打，并摇晃样品；

所述Ⅰ型胶原酶浓度为1.5mg/ml，配制方法为：在37°C条件下，将Ⅰ型胶原酶溶于TESCA缓冲液中，然后分装保存于-20°C；

S4、消化4-5小时后，加入胎牛血清培养基终止消化，1200r/min离心5min，弃掉上层液体；

S5、在S4步骤获得的离心管中加入0.25%胰酶进行消化10-20min，加入胎牛血清培养基终止消化；

S6、将上述混合物转移到培养皿中，并放到显微镜下观察，挑选完整的毛乳头，放到另一新的培养皿中，新的培养皿要预先加入胎牛血清培养基；

S7、在显微镜下利用5mm针头对上述培养皿中毛乳头周围粘连部分进行清除；

S8、对S7中的毛乳头进行挑选，转移至装有DMEM培养基的新培养皿中，并用DMEM培养基对其清洗2-3次；

S9、将S8处理好的毛乳头均匀的贴附于预先铺有鼠尾胶原的6孔细胞培养板中，所述细胞培养板的培养孔内要预先加入少量胎牛血清培养基，待毛乳头贴壁再加入1ml胎牛血清培养基，所述毛乳头从贴附到贴壁需要24小时；

S10、将上述毛乳头留置上述细胞培养板中培养一周后可进行正常传代，传代时间为49-50h。

2.根据权利要求1所述猪毛乳头细胞的培养方法，其特征在于，所述鼠尾胶原溶液浓度为1mg/mL，配制方法为：取5ml0.1mol/L的醋酸溶液加入到15ml的离心管中，加入5mg的鼠尾胶原，在室温下持续搅拌1-3小时直至溶解，配制成1mg/mL的鼠尾胶原溶液。

3.根据权利要求1所述猪毛乳头细胞的培养方法，其特征在于，所述胎牛血清培养基的配制方法为：在DMEM基础培养基中加入15%胎牛血清。