[发明专利]用于检测肺炎支原体核酸及其有无耐药基因变异的试剂盒及检测方法

说明书

提供对于检测肺炎支原体核酸及其有无耐药基因变异而言有益的用于检测肺炎支原体核酸及其有无耐药基因变异的试剂盒及检测方法。检测肺炎支原体核酸及其有无耐药基因变异的试剂盒及检测方法的特征在于，包含KOD DNA聚合酶、引物MPN‑F、引物MPN‑R、及特异性靶向荧光探针。本发明的试剂盒及其检测方法通过设计特定序列的引物及探针，达成了迅速、简便且准确地检测肺炎支原体核酸、肺炎支原体核酸23S rRNA基因及23SrRNA的第2063或者2064基因座的变异的目的。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及肺炎支原体核酸及其耐药基因变异的检测试剂盒及检测方法，该试剂盒用于在体外定性地检测痰样本、咽拭子样本、或者鼻拭子样本中的肺炎支原体23S rRNA基因及其变异，适用于肺炎支原体感染的辅助诊断。

背景技术

肺炎支原体(M Pneumonia，也简称为MP或者Mp)是人类支原体肺炎的病原体，主要经飞沫传染，潜伏期2～3周。目前肺炎支原体已成为儿童社区获得性肺炎的主要病原之一，同时是青少年和老年人呼吸道感染的常见病原体，可以引起支原体肺炎、上呼吸道感染、支气管炎、肾炎等，严重时可导致死亡。MP对抑制微生物蛋白质合成的大环内脂类抗生素、作用于DNA拓扑异构酶的喹诺酮类抗生素及四环素类抗生素均敏感。但鉴于儿童的生理特点及药物的不良反应，四环素及喹诺酮类抗生素被限制用于儿童支原体感染的治疗，大环内酯类抗生素成为临床MP感染的一线用药。随着大环内酯类药物在临床上的广泛应用，由基因突变导致的抗药现象也不断出现。近年来国内外多篇文献陆续报道临床分离出了对大环内酯类抗生素抗药的MP抗药株。德国报道，MP的抗药率为3％；日本的研究显示，2002～2006年MP的抗药率从5％增至30％以上；中国儿童MP的抗药率＞80％；更进一步增加了儿童MP肺炎及其肺外并发症治疗的难度。因此，临床开展儿童MP感染患者耐药基因的常规检测对于对支原体感染患儿的进一步有效治疗、减少肺外并发症的发生、以及对后期抗药MP感染的治疗及抗药机制的研究、抗药控制等均有一定的临床指导意义。

目前临床检测肺炎支原体主要包括分离培养法、抗原检测法、PCR检测方法以及血清学检测法。

对于分离培养法来说，从临床被检体中分离培养Mp所需的费用和工作量都比较大，需要用特殊的培养基进行一系列的传代培养，培养需要数周。即使提高培养基分离效率，这种方法诊断的敏感性也不到PCR方法的60％，但分离培养法的特异性可达到100％。

利用抗原检测技术对呼吸道感染的Mp直接进行快速抗原检测的方法包括直接免疫荧光法、反相免疫电泳技术、免疫印迹和酶联抗原免疫捕获技术。考虑到患者痰被检体中Mp的浓度大约在10²～10⁶cfu/ml，而抗原检测技术可检测的浓度范围在10～100cfu/ml，不经过Mp扩增培养的抗原检测的灵敏度十分有限，因此在能利用核酸扩增技术诊断时，不推荐应用抗原检测来诊断。

PCR诊断技术的应用已取代了传统的分离培养法，80年代后期通过对模拟临床被检体、动物模型及临床实验证明了PCR技术对Mp感染的诊断能力。美国疾控中心现在推荐使用的常规Mp PCR检测方法依据Bernet等最初设计的PCR检测方法来扩增MpATP酶基因序列区域的片段。

血清学检测方法长期以来一直是Mp诊断和流行病学研究的主要方法。对成年人的Mp感染检测精度最高的诊断方法是感染后2～3周时同时对IgM和IgG检测两次。当抗体滴度相差4倍以上为Mp阳性。有Mp感染史的患者体内IgG抗体持续升高、较长一段时间内在成年人中可能没有IgM反应，这些都是利用血清学方法单独检测Mp感染的限制。

随着抗药株的增多，在用药治疗前检测是否是抗药株非常必要，各类检测方法中，只有PCR方法可以对抗药株的基因进行分析。因此截至目前为止，仍在对用于迅速进行肺炎支原体的检测和/或抗药性检查的方法进行研究(专利文献1、2、非专利文献1)。但是，要求开发出更有用的检测试剂盒及检测方法。

现有技术文献

专利文献