[发明专利]一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种SARS‑CoV和COVID‑19病毒双重PCR检测方法，包括如下步骤：S1、准备病毒cDNA模板；S2、试剂耗材准备；S3、引物的设计；S4、病毒基因的合成；S5、单一PCR扩增；S6、双重PCR扩增及条件优化；S7、双重PCR的特异性检测；S8、双重PCR方法的灵敏度检测；本发明在病毒基因合成后通过对病毒进行单一PCR扩增和双重扩增，在扩增时需对病毒进行引物浓度条件和退火温度条件的双重优化，最后使用其他常见的呼吸系统疾病病毒进行PCR，确定建立双重PCR方法的特异性，结果显示，设计的引物只能特异性的检测到SARS‑CoV和COVID‑19两种病毒质粒模板，而对实验的其他病毒不能检测，一定程度上提高从诸多病毒中检测出SARS‑CoV和COVID‑19病毒的有效性。

技术领域

本发明属于实验室病菌检测技术领域，具体涉及一种SARS-CoV和 COVID-19病毒双重PCR检测方法。

背景技术

新型冠状病毒肺炎COVID-19是由新型冠状病毒SARS-CoV感染所致的疾病，由于新型冠状病毒肺炎具有极强的传染性，为控制病毒的传播，需通过有效的方式检测出病毒，并根据检测的病毒进行有效的控制，但是，在实验室病毒检测时，因每种病毒基因团中含有不同的病毒，如含有SARS-CoV、 COVID-19、MERS-CoV、甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒和腺病毒，检测时不能有效的从诸多病毒中检测出SARS-CoV和COVID-19病毒，且检测病毒的方法灵敏度低，因此，我们提出一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法，通过双重PCR扩增及条件优化，再进行双重PCR的特异性检测和PCR方法灵敏度检测以解决上述背景技术中提出现有技术中不能有效的从诸多病毒中检测出SARS-CoV和COVID-19病毒，且检测病毒的方法灵敏度低的问题。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法，包括如下步骤：

S1、准备病毒cDNA模板，准备SARS-CoV、COVID-19、MERS-CoV、甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒和腺病毒的模板；

S2、试剂耗材准备，准备模板克隆试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂和PCR扩增试剂；

S3、引物的设计，从GenBank获得SARS-CoV和COVID-19毒株的完整基因序列，并通过BioXM 2.6软件对病毒基因序列的保守区域进行比对，使用 Primer Premier 5软件设计每种病毒的特异性引物；

S4、病毒基因的合成，将SARS-CoV、COVID-19、MERS-CoV和甲型流感病毒H1N1进行待测基因片段合成，然后克隆至pUC57载体，测序正确后提取质粒备用；

S5、单一PCR扩增，每个反应系统的总体积为25μL，含有12.5μL 2× Master Mix，上下游引物各1μL(10pmol/L)，合成的病毒质粒模板1μL， 9.5μL的ddH2O，PCR反应条件为：94℃、3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、 30s，30个循环；72℃、10min；最后12℃保存；通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并置于凝胶成像系统中观察扩增结果；