[发明专利]基于彩色组马蹄莲多个转录组序列所开发的SSR引物组及获取方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于彩色组马蹄莲多个转录组序列所开发的SSR引物组、获取方法和应用。本发明首先利用CandiSSR方法从彩色组马蹄莲三个品种转录组拼接序列中筛选多态性SSR引物，经试验验证后确定百余个多态性SSR引物，之后再利用筛选出的35对具有高多态性的SSR引物对160余份彩色组马蹄莲品种进行多态性分析。另外本发明还基于上述研究，通过最大化策略对160份彩色组马蹄莲的核心种质进行构建，最终筛选出最佳的30个彩色组马蹄莲代表性亲本，为今后彩色组马蹄莲核心亲本的筛选、育种效率的提高以及自主知识产权新品种的加快培育提供良好的帮助。

技术领域

本发明属于分子标记技术，具体地，涉及一种基于彩色组马蹄莲多个转录组序列所开发的SSR引物组及获取方法和应用。

背景技术

近年来，第二代测序技术的发展和应用开始逐渐打破以往转录EST序列获取困难和价格昂贵的瓶颈。以Illumina/Solexa Genome Analyzer、Roche/454FLX和AppliedBiosystems SOLID system为代表的测序技术平台，通过捕捉新合成的末端的标记确定DNA序列的边合成边测序方法，可以在极短的时间，以最低的成本获取最大的数据量。虽然与传统Sanger测序方法相比，第二代测序序列相对较短，会增加后继序列拼接组装等分析的难度和计算量，但其通量大，成本低和特别适合基因组较短的转录产物测序的特点给无参考基因组信息的物种获得基因组信息带来了福音。SSR是转录组拼接EST序列中存在的，以几个核苷酸(多数为2-6个)为重复单位的一种功能性标记，除具有分布广的特点外，它还具有扩增位点专一、技术简单、重复性好、通用性强和共显性遗传等特点(Ribaut,1998)。并且由于其同候选基因处于紧密连锁水平以及开发过程简单、费用低和效率高等优点，其已成为花卉植物进行诸如多样性评价、群体进化分析、分子标记辅助育种等研究中首选的标记类型。

目前已经有多个球根花卉如百合(Lilium)、彩色组马蹄莲(Zantedeschia)和朱顶红(Hippeastrum)等，先后利用第二代测序技术开展各种组织或器官的转录组测序工作，并且开始从获得的拼接序列中开展SSR引物的开发及应用研究。如Yuan et al.(2013)筛选了494对引物百合引物对16个谱系进行扩增验证，其中172对有扩增多态性；但是Du et al.(2015)则利用包含二碱基和三碱基493对引物对32个百合谱系进行扩增验证时，仅有163对有扩增条带，57对有多态性；Wei et al.(2016)通过随机筛选的200对引物对21个彩色组马蹄莲谱系分析，确认有137对有扩增产物，而58对有多态性；Wang et al.(2018)通过对朱顶红随机筛选的335对引物在17个品种多样性扩增，共确认154对有扩增条带，98对有多态性。但是通过以上的比较可以知道，SSR引物的扩增效率在40-60％之间，而筛选出的具有多态性标记更是在20-30％之间。其实扩增效率低，多态性标记数量少等问题，同样也发生在其它植物SSR引物开发中。这虽然与SSR主要来源于编码基因，相对保守有关，但是同样也与以上的标记开发仅利用单个的或少量的拼接转录组序列有关。

与基因组SSR(gSSRs)相比，SSRs来源于转录的DNA区域，其大多数存在于功能基因中，因此可能与某些重要的表型相关，这也为它进行物种间转移和获得更普遍一致的扩增效率提供无法替代的潜在优势(Scott et al.,2000；Gupta et al.,2003)。一般上SSR多态性标记开发主要由三个独立的步骤组成，包括SSR位点的发现、引物设计和代表性群体或个体的多态性检测。传统的SSR位点的发现是昂贵的并且耗时的，需要通过SSR富集的文库构建和候选克隆测序(Sargent et al.,2003)，然后再进行后续的聚丙烯酰胺凝胶电泳和/或荧光毛细管电泳验证。而如今第二代高通量测序技术的快速发展已使SSR位点的发现和鉴定非常容易。然而我们仍需清醒的认识到，由于SSR位点来源于序列相对保守的基因编码区，其多态性肯定较差，所以如何从转录组序列中所存在的动辄上千个的SSR位点中，快速有效地筛选到大量的既有功能性又有多态性的候选标记位点就显得异常严峻和有挑战性。