[发明专利]一株高产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一株高产α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用。本发明中高产α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶的里氏木霉工程菌中四个纤维素酶基因cel5a、cel7b、cel6a、cel7a敲除失活，并插入了转录激活因子编码基因xyr1；转录激活因子编码基因xyr1在强启动子P_tcu1驱动下表达。本发明构建的里氏木霉工程菌可以稳定传代，并能够显著提高里氏木霉α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶的产量，里氏木霉工程菌的α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶酶活约是出发菌株的8～9倍，有助于里氏木霉在降解富含阿拉伯糖残基的半纤维素类物质中的应用。此外，本发明构建的里氏木霉工程菌还可用于生产木葡聚糖苷酶和纤维素内切酶。

技术领域

本发明涉及一株高产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

可降解性纤维素与半纤维素类物质是生物质资源的主要成分，其开发利用对我国经济发展、环境保护等社会核心问题具有重要的战略意义。自然界中存在一些微生物可以利用纤维素和半纤维素作为碳源和能源，在碳素循环过程中发挥重要作用。其中代表菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)能够产生多种纤维素酶和半纤维素酶，广泛应用于能源、纺织和纸浆造纸等领域。

木聚糖和阿拉伯聚糖是植物半纤维素的主要组成部分，其高效降解利用具有重要的经济价值。木聚糖和阿拉伯聚糖的降解需要多种降解酶的参与，其中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase，EC3.2.1.55)能够水解以α-1,3、α-l,2或α-1,5键连在木聚糖/阿拉伯聚糖主链上的阿拉伯糖单体或低聚阿拉伯糖侧支，是木聚糖/阿拉伯聚糖完全水解所必需的。除了能源领域，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还广泛应用于食品和饲料加工领域，市场需求量较大。

里氏木霉基因组中含有四个α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶编码基因，分别命名为abf1、abf2、abf3和bxl1，其中abf1和abf2编码两个主要的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。研究表明，abf1和abf2在槐糖或乳糖碳源条件下，能够在转录水平上表达，但是由于水平较低，胞外培养基中并不能检测到明显的酶活。迄今为止，人们并未获得过具有高水平胞外分泌产量的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的里氏木霉生产菌株，这极大限制了里氏木霉在高效降解含有阿拉伯糖残基的半纤维素类物质中的应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一株高产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用，该里氏木霉工程菌胞外α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶酶活是出发菌株的8～9倍。

本发明的技术方案如下：

一株高产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的里氏木霉工程菌，所述里氏木霉工程菌中四个纤维素酶基因cel5a、cel7b、cel6a、cel7a敲除失活，并插入了转录激活因子编码基因xyr1。

根据本发明优选的，所述转录激活因子编码基因xyr1在强启动子驱动下表达；优选的，所述强启动子为P_tcu1。

根据本发明优选的，所述里氏木霉工程菌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶酶活是出发菌株的8～9倍。

上述涉及基因均为已知序列基因，其中，基因cel5a编码蛋白的JGI蛋白ID为Tr120312，基因cel7b编码蛋白的JGI蛋白ID为Tr122081，基因cel6a编码蛋白的JGI蛋白ID为Tr72567，基因cel7a编码蛋白的JGI蛋白ID为Tr123989，基因xyr1编码蛋白的JGI蛋白ID为Tr122208。