[发明专利]一步转化标记蓝藻染色体的方法和应用

说明书

本发明公开了一步转化标记蓝藻染色体的方法和应用。本发明将四环素操纵子中的抑制蛋白TetR特异性与操纵DNA序列TetO相结合，通过一步遗传转化将TetR‑GFP融合蛋白及TetO×n序列阵列转到蓝藻基因组染色体上，然后利用启动子诱导TetR‑GFP融合蛋白的表达，表达后的TetR‑GFP融合蛋白与染色体上的TetO×n序列结合，最终得到染色体发绿色荧光的蓝藻阳性藻株，能够在荧光显微镜下观测到染色体的数目以及动态信息，从而可以将该染色体荧光标记藻株作为研究蓝藻染色体的复制和分离机制的一种理想材料。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种只进行一步遗传转化就可最终实现蓝藻染色体的荧光标记的方法和应用。

背景技术

细菌染色体的复制和分离已经在大肠杆菌、新月杆菌、霍乱弧菌和枯草芽孢杆菌等物种中得到了深入、广泛的研究。细菌没有细胞核，只一个膜包围的拟核，为了区分其与质粒DNA，现在的学者一般把拟核中大环DNA 分子称为染色体。细菌一般有1个或者2个不同的染色体，第二个染色体一般起辅助作用。

但是，蓝藻作为一种原核细菌，其染色体同其它细菌有很大的差别：1、一个蓝藻细胞含有同一条染色体的多个拷贝，一般是2-8个。2、每个蓝藻细胞的染色体数目不是固定的，目前的文献倾向于认为，蓝藻细胞内的染色体数目与细胞体积有关。3、蓝细菌的染色体复制和分离可能没有特别严格的机制，通过染色和实时定量PCR发现，蓝细菌刚分裂的子细胞含有的染色体的量会有差别，蓝细菌的每一个染色体的复制在细胞间甚至是细胞内的染色体间都是独立的，没有一个明显的时间段中多个染色体会同时复制。

不同于其他细菌，目前对蓝藻染色体的复制和分离的研究十分有限，这主要是缺乏有效标记蓝藻染色体的方法导致的。

发明内容

本发明的目的是提供一种在蓝藻中只进行一步遗传操作就能最终对蓝藻染色体荧光标记的方法，为今后研究蓝藻染色体的复制和分离机制提供一种有效的手段。

为实现上述目的，本发明将四环素操纵子中的抑制蛋白TetR(Tet repressor)特异性与操纵DNA序列TetO(Tet operator)相结合，通过一步遗传转化将TetR-GFP融合蛋白及TetO×n序列阵列转到蓝藻基因组染色体上，然后利用启动子诱导TetR-GFP融合蛋白的表达，表达后的TetR-GFP融合蛋白与染色体上的TetO×n序列结合，最终得到染色体能发绿色荧光的蓝藻阳性藻株。具体的，本发明的技术方案如下：

一种蓝藻染色体的标记方法，包括以下步骤：

(1)构建TetO序列重复n次形成的TetO序列阵列TetO×n，因为一段连续多次重复序列在细菌的遗传复制中十分不稳定，所以在每两个TetO序列之间插入10～30nt的随机碱基序列R1、R2、……、Rn，其中n为正整数，n≥60；

(2)设计构建一个染色体标记载体，这个载体具有核心元件Upstream—P₁—TetR-GFP—TetO×n—S—Downstream，其中：Upstream和Downstream代表将该核心元件通过同源双交换连入蓝藻染色体基因某个位点的上下游同源片段；P₁代表一种可以在蓝细菌中起作用的启动子；TetR-GFP是四环素操纵子中抑制蛋白TetR与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白；TetO×n是TetO序列重复n次形成的TetO序列阵列，S代表选择标记基因；

(3)将染色体标记载体转入蓝藻中，然后在有选择压力的平板培养基上连续划线传代阳性克隆，筛选纯合阳性菌株；

(4)取阳性纯合菌株检测其绿色荧光，即可观测到蓝藻染色体的荧光亮点。

上述步骤(1)中，所述TetO序列为：5’-tctctatcactgataggga-3’(SEQ ID No:1)，在本发明的一个实施例中，设计了TetO序列重复120次形成的TetO序列阵列TetO×120，其序列如序列表中SEQ ID No:2所示。