[发明专利]一种在里氏木霉中高产木聚糖酶的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种在里氏木霉中高产木聚糖酶的方法及其应用，属于生物工程技术领域。本发明通过表达转录激活因子XYR1增强木聚糖降解酶表达能力，并设计启动子Pcbh1上的转录因子结合位点，使得组成型表达XYR1能够对人工Pcbh1启动子形成进一步的激活作用，并用其表达同源木聚糖酶XYNII，获得重组里氏木霉。在纤维素诱导条件下，重组菌木聚糖酶的表达量达到6410U/mL，木糖苷酶活力达到9.08U/mL；重组菌株可以解除碳代谢阻遏，以可溶性廉价碳源葡萄糖和乳糖为发酵碳源，同样可以获得2514U/mL和3446U/mL的胞外木聚糖酶活，同时木糖苷酶产量较亲本提高了9.3倍和2.3倍。

技术领域

本发明涉及一种在里氏木霉中高产木聚糖酶的方法及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

木聚糖是主要由木糖通过β-1，4-糖苷键组成的多聚糖，常见于植物中，是仅次于纤维素的第二大碳水化合物。与纤维素不同的是，木聚糖β-1，4-主链多由乙酰基、阿拉伯呋喃基以及葡糖醛酸等侧链取代基修饰形成异质木聚糖，因此，木聚糖的充分降解需要多种酶的协同作用。木聚糖酶是一类能够降解木聚糖的水解酶的总称，包括内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酶等。其中，内切木聚糖酶主要对木聚糖主链进行切割，协同β-木糖苷酶以及其他侧链水解酶，使具有复杂结构的木聚糖被降解为单糖。内切木聚糖酶广泛应用于生物能源，饲料以及食品行业。尤其是近年来，木聚糖酶作为辅助酶参与生物质转化以及饲料领域越来越受到关注，但是其较高的生产成本与较低的产量不能满足市场的需求，阻碍了木聚糖酶大范围的利用。

通过基因工程手段改造细胞工程菌株表达木聚糖酶是获得大量木聚糖酶的有效手段。Ouephanit等在毕赤酵母中表达青霉来源的木聚糖酶，产量达到676 U/mL; Long等通过双质粒手段在毕赤酵母中表达了黑曲霉来源的木聚糖酶XYNC，最终在5L罐中胞外木聚糖酶活力达到1650 U/mL；Miyauchi等在里氏木霉中异源表达灰腐质霉的木聚糖酶，产量达到1780 U/mL。异源表达木聚糖酶会受到诸多限制，例如蛋白降解以及折叠不充分引起的非折叠蛋白响应等，都会阻碍重组蛋白产量的进一步提高。Li等在里氏木霉中组成型表达了同源木聚糖酶XYNII，在7%葡萄糖和5%豆饼粉的复杂培养基上产量高达9266 U/mL，而对木聚糖的高效降解需要多种木聚糖降解酶的协同作用，因此高效生产具有多种木聚糖降解酶组分的木聚糖酶体系能够广泛满足能源以及饲料领域的大规模生产与应用。

里氏木霉中 Pcbh1启动子多用于重组蛋白的表达。同时 Pcbh1启动子还受到多种转录因子如XYR1，CRE1以及ACE1等的调控。Zou等以及Liu等通过 Pcbh1启动子改造使重组蛋白的表达量提高了2.5-5.5倍不等。Daniel等发现xyn1启动子上的反向GGCTAA区域对xyr1结合与激活至关重要，且通过对 Pcbh1启动子进行改造，使重组GoxA的活力在木聚糖培养基上提高20.26倍为了进一步增强启动子的强度。Sun等通过替换 Pcbh1启动子上的ACE1识别位点为GGCTAA, 使重组甘露糖苷酶的活力提升5倍。

丝状真菌里氏木霉能够在纤维素及其低聚物诱导下大量表达纤维素酶、木聚糖酶，其表达的GH11家族的木聚糖酶XYNII具有较高的催化活力与稳定性，具有较大的应用价值。

发明内容

[技术问题]