[发明专利]一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法

权利要求书

1.一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、免疫细胞CIK的分离包括以下过程：

（1）、在生物安全柜中，将外周血用电动助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml离心管中，设定离心参数升9降7，2000rmp，离心8min；

（2）、外周血离心后先吸取上层血浆至50ml离心管中，取四个EP管，每管加入1.0ml血浆，水浴锅中56℃灭活30min，3000rpm离心10min，取上层血浆至洁净50ml离心管中，备用；

（3）、用NA稀释血细胞，使得血细胞：NA为1:1。

步骤二、细胞CIK的无血清体外扩增包括以下步骤：

（1）、免疫细胞的起始培养；

离心收集全部细胞，用30ml CIK培养液（里面添加自体血清1.5ml，5%）重悬，及加2mlCIK扩增试剂，设定离心参数，升9降7，2000rpm，离心8min，倒弃剩余上清。用电动助吸器吸取15mlCIK细胞培养液至离心管中，悬浮沉淀，吹打混匀后加入培养瓶中，加CIK细胞培养液15ml离心管并转入培养瓶中，水平放置在37℃、7.5%的CO2培养箱中培养。

（2）免疫细胞的无血清培养；

细胞培养至第3天离心、换液、换瓶：收集细胞离心，1500转，5分钟。离心后的细胞沉淀加含5%自体血浆的CIK细胞培养液30ml重悬，第4-6天，根据实际生长情况，进行添液，转移培养袋：第7天计数，细胞数量大于1*108，则加入4ml扩增试剂，如细胞数量在3~8*107则长至第8天再添加扩增试剂。加含5%自体血浆的CIK细胞培养液使总细胞浓度在1.0*106Cell/m。培养液体积大于200ml或细胞数量大于1*108，则可以转移至培养袋培养；第8~11天每天观察，加含1%自体血浆的CIK细胞培养液使得细胞浓度在1*106Cell/ml左右；第12~14天每天观察，添液使得细胞浓度在2*106Cell/ml左右。当细胞生长至所需数量时即可进行收集使用或冻存。一般情况下，建议13或14天收集细胞；

步骤三、分析细胞CIK的生长曲线；

步骤四、分析细胞CIK表面抗原表达；

步骤五、分析细胞CIK周期；

步骤六、免疫细胞CIK的冻存及复苏，实验组设置有四组免疫细胞CIK的冻存实验和一组对照组，且五组实验分别冻存10天和30天；

步骤七、免疫细胞各项指标检测。

2.根据权利要求1所述的一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法，其特征在于：所述步骤一中的过程（3）中，混匀后均匀缓慢地加至相应的A液上层，形成完整的界面，设定离心参数升6降4，1600rpm，离心20min，吸弃第一层上清，小心轻柔地将第二层的白色细胞层吸至洁净50ml离心管中，各管中加NA，稀释混匀，定容至50ml/管，设定离心参数升9降7，2000rpm，离心8min，吸弃上清，加10ml NA/管，重悬细胞。

3.根据权利要求1所述的一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法，其特征在于：所述步骤三中，采用台盼蓝染色法检测细胞活性，并绘制出相应的细胞生长曲线。

4.根据权利要求1所述的一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法，其特征在于：所述步骤四中，采用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD56、CD8抗原。

5.根据权利要求1所述的一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法，其特征在于：所述步骤五中，采用流式细胞仪检测细胞周期。