[发明专利]Gpm6b调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体的是Gpm6b调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用。分化方法的步骤：OC‑1细胞培养；siRNA敲低Gpm6b基因，采用N1301、N885、N1082三种不同的siRNA敲减OC‑1细胞中的Gpm6b基因；Lgr5+祖细胞的分离培养及Gpm6b基因敲低，Lgr5+祖细胞消化成单细胞后，采用流式细胞分选技术进行分选，经培养后再Gpm6b基因敲低；Gpm6b基因敲低对Lgr5+祖细胞增殖/分化的影响，采用细胞成球实验、EdU染色实验和免疫荧光实验研究Gpm6b基因敲减对Lgr5+细胞增殖/分化的影响，再评估Lgr5+细胞增殖、分化为毛细胞的能力；数据分析，采用GraphPadPrism 6进行数据统计分析。本发明敲低Gpm6b基因后对于Lgr5+细胞成球有抑制作用，即Gpm6b敲低抑制Lgr5+细胞增殖。而Gpm6b基因敲减对Lgr5+细胞分化再生毛细胞无调控作用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的是Gpm6b调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用。

背景技术

截至2018年年底，全世界已有轻度听力受损者近6亿，中度以上2.5亿。2018年我国有听力障碍残疾人九千多万，居各类残疾之首；耳鸣发病率有15％-20％，而综合治疗率不到20％。目前，感音神经性聋占耳聋患者63％。损害毛细胞造成听力障碍的因素主要有衰老、噪音、环境化学毒素、氨基糖苷和先天遗传。同时，哺乳动物耳蜗的再生能力仅在胚胎发育和新生儿早期阶段，成年的哺乳动物毛细胞缺乏自发的形成新的成熟毛细胞的能力，因而损伤后造成了永久性听力障碍。目前临床上常用的助听器和人工耳蜗移植治疗岁在一定程度上改善了患者的听力，但治标不治本。因此，最理想的治疗方法是通过干细胞替代治疗，再生毛细胞和螺旋神经元，促进螺旋神经元神经突的生长，从根本上修复耳蜗结构和功能，恢复听觉功能。如何修复和再生损失或丢失的螺旋神经元，如何使损伤后的毛细胞再生，是目前听觉领域研究的热点。

造成感音神经性耳聋的主要原因有耳蜗毛细胞的损伤以及毛细胞损伤后螺旋神经元的神经突退化或螺旋神经元死亡。而螺旋神经元的不可逆损伤是感音神经性耳聋的主要病因。内耳包括耳蜗和前庭，耳蜗感受声音，毛细胞感受到压力后产生动作电位，传递至神经，到螺旋神经节神经细胞，继而传递到听觉皮层。而内耳干细胞可自生并多次继代培养，可表达分化为毛细胞所需的关键转录调节因子以及毛细胞结构蛋白。

神经元膜糖蛋白基因(Gpm6b)编码一种四跨膜蛋白，属于蛋白脂类蛋白家族，广泛表达于神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。Gpm6b是一个在成骨细胞分化过程中强烈上调的基因，在维生素D和激活素A的作用下分别升高和降低。既往研究表明，Gpm6b在神经分化、髓鞘形成和成骨细胞分化中发挥作用。

同时，非哺乳动物脊椎动物可从成年干细胞或前体细胞中再生出新的毛细胞，但哺乳类耳蜗不能自发地产生新的成熟毛细胞，新生小鼠耳蜗损伤后可再生新的毛细胞，但成年哺乳动物毛细胞缺乏再生能力。

发明内容

为解决上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于提供Gpm6b调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用，解决了部分动物毛细胞缺乏再生能力的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

Gpm6b调控内耳干细胞增殖分化方法，包括以下步骤：

一、OC-1细胞培养

将小玻片放入24孔皿中，加1ml ddH₂O或PBS，吹洗3遍，紫外照射半小时后进行种细胞，细胞量为200ul/大皿，画“8”字或“十”字分散细胞，置于33℃、5％CO₂的培养箱中；

二、siRNA敲低Gpm6b基因

采用N1301、N885、N1082三种不同的siRNA敲减OC-1细胞中的Gpm6b基因；

三、Lgr5+祖细胞的分离培养及Gpm6b基因敲低