[发明专利]一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用，所述重组产黄青霉基因工程菌由原始产黄青霉菌中StuA基因被Bleo抗性基因替代所得。本发明所提供的基因工程菌使产黄青霉在固定化发酵生产青霉素过程中生物膜量OD570增多了约2.5倍，使菌丝更好的吸附结合在塑料介质上；提高了菌种的抗逆性，使发酵过程中菌种形态更稳定；提高了青霉素的效价达到2126.775U/mL，同时缩短了整个发酵周期约24h，从而提高了发酵效率并减少了生产成本，有效解决了现有技术中产黄青霉发酵生产青霉素菌种形态不稳定，发酵周期长且持续性差，导致发酵效率低且成本高的问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

青霉素分子中含有6-氨基青霉烷酸(6APA)并作用于处于繁殖期的细菌细胞壁，作为β-内酰胺类抗生素的一种，自1929年被发现至今仍然在医疗健康领域发挥着极其重要的作用。青霉素有天然青霉素与半合成青霉素之分，二者生产方法截然不同。天然青霉素是通过菌种发酵然后进行提取精制获得，而半合成青霉素则是以微生物产生的青霉素裂解而成的中间体与有机酸进行酰化反应制得的。

工业化生产青霉素距今已有六十多年历史，随着菌种的改良与发酵工艺的改进，目前青霉素的产率相比原始产黄青霉菌提高了很多，并且成本大幅降低。但传统青霉素的工业化生产方法在发酵后期，菌体形态发生变化、代谢物阻遏效应严重还可能产生菌体自溶现象，严重影响了整体发酵的经济效益。针对这种状况，本发明采用基于生物膜的固定化方法，实现丝状真菌的固定化发酵。

生物膜是被自分泌胞外基质包裹的有形态群体，附着于有生命或无生命的物体表面。生物膜主要由脂质、蛋白质、糖类与eDNA、金属离子和水组成。目前对真菌生物膜的研究主要集中在解决真菌产生生物膜引起的炎症与其在医用设施上形成生物膜造成的损失等方面，很少有研究将生物膜机制引入真菌的工业化发酵中来。生物膜形成后，菌落显示出由信号分子介导的集群效应，使细胞自增殖、自修复和抗衰老的能力增强，从而使的生命周期得到延长，抗逆性增强，使实现高效且稳定的固定化工业生产成为可能。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株重组产黄青霉基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组产黄青霉基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组产黄青霉基因工程菌的应用。

发明思路：StuA基因通过调控真菌的营养生长、孢子形成和次生代谢过程，影响生物膜糖类的主要组成成分-乳糖氨基半乳糖(GAG)的合成与菌种的毒力。研究已证明生物膜的形成与GAG的合成与菌种毒力密切相关。通过实验，本发明中StuA基因能够调控生物膜的生成，影响发酵的固定化程度、发酵周期以及菌种抗逆性等，因而可以在固定化发酵青霉素的工业生产上得到应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株重组产黄青霉基因工程菌，由原始产黄青霉菌中StuA基因被Bleo抗性基因替代所得。

其中，所述原始产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)为ATCC48271。

其中，所述StuA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，所述StuA基因被bleo抗性基因替代后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述重组产黄青霉基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)制备原始产黄青霉菌的原生质体；

(2)提取原始产黄青霉菌的基因组DNA；

(3)构建基因敲除片段；