[发明专利]一种用于检测耐药基因适应性代价的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法

说明书

本发明提供了一种用于检测耐药基因适应性代价的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法，通过Crisper技术在大肠杆菌的attb位点插入sfgfp基因，并导入包含p15a低拷贝复制子、卡那霉素抗性基因kan和多克隆位点MCS的pAKM质粒，构建得到一种用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌，其本身不存在适应性代价，可用于更加准确、稳定、快速、高效地检测目标耐药基因在待测菌株中的适应性代价，适用于耐药基因(含整合子等耐药可移动原件)的适应性代价分析。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及一种用于检测耐药基因适应性代价的基因工程菌及其构建方法，尤其涉及一种用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌及其构建方法。

背景技术

细菌耐药性往往伴随适应性代价的出现，包括生长速率减缓和毒力下降等现象。在无抗菌药物或抗菌药物选择压力较低的环境中，适应性代价可致敏感菌株的数量超过耐药菌株。细菌耐药性致适应性代价影响细菌耐药性产生的速度，即减少抗菌药物的使用，可降低耐药菌株在环境中的比例，进而减缓或防止耐药性的产生。近年来，细菌耐药性问题日益严峻，且产生的速度和程度依然没有减缓的迹象。因此正确检测和评价细菌的适应性代价，可以为如何利用耐药性所致的适应性代价来减缓或阻止耐药性的产生提供参考。

因此急需建立一种更准确高效的适应性代价检测方法，但是由于适应性代价只能通过相对值来进行表征，所以还需尽快建立一种用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌，所述的检测对照菌必须具备易于准确分辨的标志分子，且本身不存在适应性代价，并能排除环境等因素带来的不良影响，才能准确稳定检测出目标耐药基因在待测菌株中的适应性代价。

通过基因工程方法构建含靶标序列的试验菌株，通过含靶标序列试验菌株和不含靶标序列的对照菌株间的竞争试验(competition experiments)，利用流式细胞术等方法分析菌株相对频率(relative frequency)，计算选择系数(selection coefficient)，从而判断菌株的适应性代价，是迄今最高效的适应性代价研究方法(Lacotte et al.,2017；Roch et al.,2017；Starikova et al.,20122013)。不同表达株的选择系数由对应表达株出现的频率与对应传代时间的线性回归斜率决定(Lenski et al.,1991)。文献(Lacotteet al.,2017)“Class 1integrons are low-cost structures in Escherichia coli”，公开了一种通过位点特异性重组的方法，在大肠杆菌E.coli MG1655ΔlacZ的λatt位点插入kan-frt-gfpmut3基因盒构建检测对照菌，将I型整合子插入质粒pZA2并导入大肠杆菌E.coli MG1655ΔlacZ构建检测试验菌，利用上述方法分析I型整合子的整合酶活性、Pc启动子多态性、基因盒个数及大小，SOS应答反应调控等因素对选择系数的影响，从而推断出I型整合子在大肠杆菌中是低适应性代价的结构。

整合子因其在细菌耐药性的产生和传播中发挥着至关重要的作用而备受关注。它是通过位点特异性基因重组来捕获、剪切或整合基因盒，使耐药基因能够在细菌间进行水平转移的一类可移动遗传元件。较常见的整合子有I型整合子和II型整合子。II型整合子在水产品致病菌或条件致病菌耐药基因传播扩散中的作用十分重要。但II型整合子结构中各重要元件发挥功能所产生的适应性代价及该结构在应对不同环境时所产生的适应度代价仍需进一步研究阐明。

为此，本研究小组将文献(Lacotte et al.,2017)方法应到I型整合子和II型整合子适应性代价的检测，但在适应性代价检测过程中，出现荧光信号较弱、不稳定，检测精确度差，重复性差等问题，尤其是II型整合子，检测结果非常不稳定，因此该方法检测I型整合子和 II型整合子或耐药基因的适应性代价存在一定缺陷。