[发明专利]一种用于检测耐药基因适应性代价的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法

权利要求书

1.一种用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌，其特征在于，包含大肠杆菌的基因组；所述的大肠杆菌基因组的attb位点包含sfgfp基因；所述sfgfp基因是通过Crisper技术插入大肠杆菌的attb位点；所述的大肠杆菌基因组还包含pAKM质粒，所述pAKM质粒包含p15a低拷贝复制子、卡那霉素抗性基因kan和多克隆位点MCS。

2.如权利要求1所述的检测对照菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌E.coliMG1655△lacZ；所述包含sfgfp基因的attb位点的序列如Seq ID NO.1所示；所述sfgfp基因的序列如Seq ID NO.2所示；所述检测对照菌的保藏编号为CCTCC NO:M2021051。

3.如权利要求1所述的检测对照菌，其特征在于，所述pAKM质粒的序列如Seq ID NO.3所示；所述p15a低拷贝复制子的序列如Seq ID NO.4所示；所述卡那霉素抗性基因kan的序列如Seq ID NO.5所示；所述多克隆位点MCS的序列如Seq ID NO.6所示。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的检测对照菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)利用Crisper技术在大肠杆菌的attb位点插入sfgfp基因，获得大肠杆菌工程菌；

2)构建带有p15a低拷贝复制子、卡那霉素抗性基因kan和多克隆位点MCS的pAKM质粒；

3)将pAKM质粒导入步骤1)获得的大肠杆菌工程菌。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1)包括分别扩增大肠杆菌基因组的attb位点的上游同源臂、下游同源臂及sfgfp基因片段，经融合PCR扩增后，通过Crisper技术整合至大肠杆菌基因组。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述上游同源臂的正向扩增引物具有如序列表Seq ID NO.7所示的序列，反向扩增引物具有如序列表Seq ID NO.8所示的序列；下游同源臂的正向扩增引物具有如序列表Seq ID NO.9所示的序列，反向扩增引物具有如序列表Seq ID NO.10所示的序列；sfgfp质粒的正向扩增引物具有如序列表Seq ID NO.11所示的序列，反向扩增引物具有如序列表Seq ID NO.12所示的序列。

7.一种耐药基因或耐药可移动元件适应性代价的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将待检测适应性代价的目标耐药基因或耐药可移动元件插入pAKM质粒的MCS位点，构建pAKM重组质粒；

b)将pAKM重组质粒转入大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ，构建检测试验菌；

c)将如权利要求1-3任一项所述的检测对照菌和步骤b)获得的检测试验菌进行竞争试验，通过流式细胞技术分析获得竞争实验中检测试验菌和检测对照菌的相对频数，分析获得目标耐药基因的适应性代价。

8.一种在attb位点包含sfgfp基因的大肠杆菌在适应性代价检测或制备用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌上的用途，所述大肠杆菌利用Crisper技术在attb位点插入sfgfp基因。

9.Crisper技术在制备用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌上的用途。

10.一种pAKM质粒在制备用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌上的用途，所述pAKM质粒包含p15a低拷贝复制子、卡那霉素抗性基因kan和多克隆位点MCS。