[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒的引物、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒的引物，其特征在于，包括上游引物PEDV-MF和下游引物PEDV-MR，分别具有以下碱基序列：

上游引物PEDV-MF：5’-GGGCGCGTGTATAGAGTTTA-3’，

下游引物PEDV-MR：5’-GACATAGAAAGCCCAACCAG-3’。

2.一种猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物，并记为PCR Mix。

3.根据权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、反转录试剂和PCR扩增液。

4.根据权利要求2或3所述的一种猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，PCR Mix中，上游引物PEDV-MF和下游引物PEDV-MR的摩尔比为1:1。

5.根据权利要求3所述的一种猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为含有PEDV基因序列的重组质粒。

6.根据权利要求3所述的一种猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照为双蒸水。

7.根据权利要求3所述的一种猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增液包括Taq PCR Mix(2×)。

8.如权利要求2～7任一所述的猪流行性腹泻病毒的试剂盒的应用，其特征在于，将其应用于猪流行性腹泻病毒的检测，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的总RNA，加入反转录试剂，反转录得到样品cDNA备用；

(2)配置反应体系：取样品cDNA、PCR Mix、PCR扩增液，并用双蒸水定量至一定体积，配制反应体系；

(3)RT-PCR扩增；

(4)琼脂糖凝胶电泳；

(5)参照待测样品对阳性对照和阴性对照进行处理；

(6)结果判定。

9.根据权利要求8所述的猪流行性腹泻病毒的试剂盒的应用，其特征在于，步骤(6)中的结果判定方法为：

阳性对照出现669bp扩增条带，阴性对照无条带出现时，实验结果成立；被检测样品出现669bp的扩增条带为猪流行性腹泻病毒核酸阳性，否则为阴性。

10.根据权利要求8所述的猪流行性腹泻病毒的试剂盒的应用，其特征在于，包括以下条件中的任一项或多项：

(i)步骤(1)中，取RNA4μg，反转录的条件为：42℃下进行45min；

(ii)步骤(2)的反应体系中，样品cDNA 2μL，PCR Mix 2μL，PCR扩增液12.5μL，并加入双蒸水10.5μL定量至25μL；

(iii)步骤(3)中，扩增程序为：94℃5min，循环为94℃30s，55℃30s，72℃1min，共计35个循环，72℃10min；

(iv)步骤(4)中，琼脂糖凝胶电泳的方法为：将琼脂糖放入TAE中，制得1％的琼脂糖凝胶，微波溶解，再加入5μL的核酸染料轻轻摇匀，在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后取10μL PCR扩增产物，点样于琼脂糖凝胶孔中，以110-120V电压于TAE电泳缓冲液中电泳，待Marker和条带都跑开后，由凝胶成像仪观察并拍照，获得检测结果。