[发明专利]一种标准品载体及其在测定重组腺相关病毒滴度中的应用

说明书

本发明公开了一种用于测定重组腺相关病毒滴度的标准品载体，所述标准品载体含有常用BGHpA和SV40pA元件，且两个ITR外侧分别具有一个MlyI酶切位点，能酶切产生ITR平末端，当用MlyI酶切标准品载体骨架后，回收的线性化rAAV标准品片段中仅包含转基因表达框及两侧ITR序列，该标准品不包含任何的骨架序列，在最大程度上模拟了野生型AAV病毒的ITR结构，保证了rAAV病毒滴度测定的准确性，具有高效、准确、重复性好的特点，克服了现阶段AAV标准品制备不合格引起的qPCR检测结果不准确的问题。

技术领域

本发明属于慢病毒病毒滴度检测技术领域，具体涉及一种标准品载体及其在测定重组腺相关病毒滴度中的应用。

背景技术

重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)因其非整合、无致病性、携带的治疗基因表达时间长、靶向性好等特点被广泛应用于基础研究和临床基因治疗中。目前，针对不同疾病已进行了接近200例rAAV临床试验，且有许多研究性新药正处于FDA和EMA的不同审查阶段，首个基于rAAV的基因治疗药物Glybera已于2012年被欧盟批准用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)。尽管rAAV的临床试验已证明其良好的疗效及高度的安全性，但rAAV剂量缺乏统一有效的标准化测定方法仍然是阻碍其商业化的限制因素。因此，建立合适的质量控制方法以精确测定rAAV的准确剂量显得至关重要。

病毒滴度(vg/ml)是rAAV临床治疗中衡量rAAV病毒剂量的重要指标。目前应用最广泛的rAAV病毒滴度测定方法是实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)。qPCR法是在PCR体系中加入荧光基团以实时监测扩增过程中荧光信号的变化，然后通过标准曲线对待测样品进行定量，主要包括SYBR Green I法和TaqMan探针法。与TaqMan探针法相比，SYBR Green I法不需要探针，成本低廉，因此更适用于大规模的rAAV病毒滴度测定中，本发明即采用SYBR Green I法对rAAV进行病毒滴度测定。SYBR Green I法使用SYBRGreen I染料作为荧光标记物，它能特异性地结合双链DNA并发射荧光信号，通过已知浓度的标准品制定出标准曲线，从而换算出待测rAAV病毒基因组的拷贝数。该方法具有灵敏度高、特异性强、简便快捷等特点，只需2～3个小时即可得到结果。

准确定量rAAV病毒滴度是实现精确给药剂量和保障患者安全的前提条件。基于SYBR Green I的qPCR检测方法的准确性取决于能否得到精确的标准曲线，其中合格标准品的制备显得尤为关键。rAAV基因组包括上下游145nt的反向末端重复序列(InvertedTerminal Repeat,ITR)及两者之间的转基因表达盒。目前，研究者们主要采用两种策略来测定rAAV滴度，一种是针对特定的转基因序列或者polyA序列来设计qPCR引物，但由于不同AAV载体中转基因及polyA序列的可变性，因此该方法并不是一种通用的rAAV滴度测定方法。另外一种是将上下游qPCR引物设计在rAAV载体的ITR上，由于大部分研究者采用酶切线性化的方法，将两个ITR以及两者之间的转基因表达盒连同部分骨架序列回收作为标准品，导致同一样品的滴度测定出现了实验室间及实验室内的偏差。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种标准品载体。

本发明的第二个目的在于提供一种标准品。

本发明的第三个目的在于提供上述标准品载体的构建方法。

本发明的第四个目的在于提供一种试剂盒。

本发明的第五个目的在于提供一种测定重组腺相关病毒滴度的方法。

本发明的第六个目的在于提供上述标准品载体或标准品或试剂盒在测定重组腺相关病毒滴度中的应用。

本发明所采取的技术方案是：