[发明专利]一株过表达Gis4的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一株过表达Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌，该菌株由原始酿酒酵母的Gis4基因过表达后改造得到。由于原始菌株在固定化发酵中菌体聚集过多且聚集体不成熟，电阻较高，阻碍了传质传导，导致其发酵周期的加长，而过表达Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵中絮凝特性明显减弱，在固定化发酵中细胞粘附聚集情况减少，黏附性降低，游离细胞增多，加强了传质传导，缩短了发酵周期。

技术领域

本发明属于基因工程及微生物技术领域，具体涉及一株过表达Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

生物膜也称为生物被膜，是一种由微生物细胞和其分泌的胞外基质共同组成的生物聚集体，由微生物集群与其分泌出的多糖、蛋白、脂肪酸等形成膜状结构附着于载体表面。生物膜的存在，不仅作为屏障为细胞的生命活动创造了稳定的内环境，介导了细胞与细胞、细胞与基质之间的连接，而且还承担了物质转运、信息的跨膜传递和能量转换等功能，更重要的是，生物膜还作为一种重要的工业应用——固定化发酵。与游离细胞发酵相比，固定化发酵中所形成的生物膜能在发酵过程中表现出较高的底物耐受性和较快的发酵效率。通常条件下，常规的游离细胞发酵50g葡萄糖大约需要8h左右，而固定化细胞只需要6h就可以将糖转化为乙醇，展现了固定化细胞出色的发酵效率和发酵能力。但生物膜过多，会造成菌体聚集过多且聚集体不成熟，电阻较高，阻碍了传质传导，导致其发酵周期的加长。

发明内容

发明目的：针对现有的酿酒酵母菌株在生物膜固定化发酵过程中生成的生物膜过多的问题，提供一株过表达Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌，可定向减少细胞与载体的粘附性，加强传质传导，提高发酵效率。

本发明还要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的应用。

发明思路：有数据表明，Gis4抑制Snf1基因的表达，而Snf1调节Flo11基因的转录，Flo11又是介导生物膜形成过程中细胞与介质黏附的关键因子。。因此，本发明选取Gis4基因作为改造对象，构建酿酒酵母基因工程菌，以定向减弱菌株在生物膜形成过程中细胞与载体的黏附能力，，进而提高发酵效率和发酵能力。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母的Gis4基因过表达。

其中，所述酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae1308，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 1308，可商购得到。

其中，所述Gis4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明进一步提出了上述的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以Saccharomyces cerevisiae1308基因组DNA为模板，扩增出Gis4目的基因片段；

(2)利用限制性内切酶获得线性化质粒pYX212，将Gis4目的基因片段与线性化质粒pYX212导入大肠杆菌DH5α中，获得DH5α-pYX212-Gis4菌株，提取所获得的目标大肠杆菌的质粒；

(3)将步骤(2)得到的质粒转化至酿酒酵母感受态中，即得过表达酿酒酵母基因工程菌。

其中，步骤(2)中，所述限制性内切酶为SacI。

步骤(2)中，用限制性核酸内切酶对获得质粒进行酶切验证，利用凝胶电泳对取得质粒进行可视化初筛。

步骤(1)中，扩增Gis4基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

步骤(1)中，所述Gis4基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。