[发明专利]基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.pCMV-Cas9-4xsgRNA表达载体，其特征在于，所述表达载体包含Cas9蛋白、EGFP标记和4个表达sgRNA功能域的表达载体。

2.根据权利要求1所述的pCMV-Cas9-4xsgRNA表达载体，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体是通过将多对靶向靶点基因的双链DNA片段重组至pCMV-Cas9-4xsgRNA载体中获得。

4.权利要求3所述的基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）构建pCMV-Cas9-4xsgRNA表达载体，所述的载体核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

2）设计多对打靶位点，依据打靶位点合成多对用于合成靶向sgRNA的Oligo DNA，将每对Oligo DNA退火合成双链DNA；

3）使用酶切连接的方法将多对靶向靶点基因的双链DNA片段重组至pCMV-Cas9-4xsgRNA载体中，即合成靶向于多个基因靶点的单个载体。

5.根据权利要求4所述的基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，所述多位点为4个位点，所述步骤2）中设计4个打靶位点，所述4个打靶位点合成4对Oligo DNA，4对Oligo DNA退火合成双链DNA1~4，其中4对Oligo DNA分别具有以下规律：

正向Oligo DNA 1，5’-CACCG（N）NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；

反向Oligo DNA 1，5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN（N）C-3’；

正向Oligo DNA 2，5’-CACCG（N）NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；

反向Oligo DNA 2，5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN（N）C-3’；

正向Oligo DNA 3，5’-CACCG（N）NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；

反向Oligo DNA 3，5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN（N）C-3’；

正向Oligo DNA 4，5’-ACCG（N）NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；

反向Oligo DNA 4，5’-AACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN（N）C-3’；

其中，“(N)NNNNNNNNNNNNNNNNNNN”分别为打靶位点1、2、3和4。

6.根据权利要求5所述的基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，所述步骤3）中的具体方法为：将质粒pCMV-Cas9-4xsgRNA使用Bbs I酶切，连接退火后的双链DNA 1，即获得重组质粒pCMV-Cas9-4xsgRNA-DNA1；将质粒pCMV-Cas9-4xsgRNA-DNA1使用Bsa I酶切，连接退火后的双链DNA 2，即获得重组质粒pCMV-Cas9-4xsgRNA-DNA1-DNA2；将质粒pCMV-Cas9-4xsgRNA-DNA1-DNA2使用BsmB I酶切，连接退火后的双链DNA 3，即获得重组质粒pCMV-Cas9-4xsgRNA-DNA1-DNA2-DNA3；将质粒pCMV-Cas9-4xsgRNA-DNA1-DNA2-DNA3使用Sap I酶切，连接退火后的双链DNA 4，即获得重组质粒pCMV-Cas9-4xsgRNA-DNA1-DNA2-DNA3-DNA4。

7.权利要求3所述的载体在构建用于实现真核生物多个基因同时敲除的细胞系中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述载体转染真核生物细胞，筛选，即得靶点敲除的细胞系。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述转染方法包括脂质体转染或电转染。