[发明专利]一种同时检测多种长链非编码RNA的复合物及方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种同时检测多种长链非编码RNA的复合物及方法。复合物包括磁珠、报告单元和生物素化的捕获探针；报告单元至少为两个；报告单元是由辅助探针、荧光团标记的信号探针A和荧光团标记的信号探针B的DNA杂交链反应构建的长一维DNA连接体，辅助探针与部分信号探针A杂交，信号探针A和信号探针B彼此相互交替杂交；所述捕获探针的3’端标记有biotin生物素并与磁珠相连，捕获探针的5’端与报告单元杂交形成部分互补双链。当靶lncRNA存在时，该复合物可以催化链置换反应从而释放荧光分子，随后可通过单分子检测对其进行定量，没有引入核酸扩增方法，可以在无酶系统中进行，具有显著优势。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种同时检测多种长链非编码RNA的复合物及方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

长链非编码RNA(lncRNA)是从基因组转录而来的非蛋白编码RNA分子，在表观遗传学、转录后调控和染色质修饰中起着至关重要的作用。LncRNA是一类长度超过200nt的非编码RNA，起初被认为是酶转录的副产物和基因转录的“噪音”，没有生物学功能。然而，最近的研究表明，lncRNA具有广泛的进化保守性，并且在生物体中稳定存在。LncRNA参与基因组印迹，染色质建模和各种生物学过程，在各种肿瘤和病理过程(例如细胞增殖、分化和凋亡)的发生和发展中发挥关键作用，并可以通过调节基因的表达水平来影响癌症的转化和发展。因此，lncRNA可以作为肿瘤早期诊断的临床有用的生物标志物。

传统的lncRNA的检测方法包括微阵列、RNA测序、定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和数字PCR(dPCR)，这些方法中涉及大量数据处理，复杂的探头设计和精确的温度控制，这不仅增加了实验成本和难度而且费时费力，灵敏度低。为了克服这些问题，一些核酸扩增方法被开发出来，包括滚环扩增(RCA)，环介导的等温扩增(LAMP)和指数扩增反应(EXPAR)，这些扩增方法可以在数分钟内以高扩增效率产生丰富的寡核苷酸，但发明人发现，它们可能不可避免地涉及多种酶，例如DNA聚合酶，核酸内切酶和核酸外切酶。而且，由于lncRNA的大尺寸和广泛的二级结构，使得同时检测它们仍然是一个巨大的挑战。因此，如何提供一种在不涉及任何核酸扩增和酶的情况下，实现简单、高效地同时检测多种lncRNA将具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供一种同时检测多种长链非编码RNA的复合物，当靶lncRNA存在时，可以催化链置换反应从而释放荧光分子，随后可通过单分子检测对其进行定量。该方法的双重靶向性，良好的选择性和高灵敏度使得能够在单细胞水平上同时检测癌细胞中的多个lncRNA。重要的是，该链置换方法具有序列设计简单且不需要酶的介导的独特优势，在活细胞成像和癌症的早期临床诊断中具有巨大潜力。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种同时检测多种长链非编码RNA的复合物，包括磁珠、报告单元和生物素化的捕获探针；报告单元、捕获探针至少为两个；报告单元是由辅助探针、荧光团标记的信号探针A和荧光团标记的信号探针B的DNA杂交链反应构建的长一维DNA连接体，其中，辅助探针与部分信号探针A杂交，信号探针A和信号探针B彼此相互交替杂交。

所述捕获探针的3’端标记有biotin生物素并与磁珠相连，捕获探针的5’端与报告单元(即报告单元中的辅助探针)杂交形成部分互补双链。

本发明第二方面提供一种上述复合物在检测长链非编码RNA中的应用。

本发明第三方面提供一种同时检测多种长链非编码RNA的方法，具体包括：

(1)制备上述同时检测多种长链非编码RNA的复合物；

(2)进行细胞培养和总RNA提取；

(3)LncRNA测定，并进行磁分离释放荧光团；