[发明专利]提高威兰胶表达的多酶复合体载体及高产威兰胶的重组菌

说明书

本发明公开了一种提高威兰胶表达的多酶复合体载体及高产威兰胶的重组菌，属于分子生物学技术领域。本发明提高威兰胶表达的多酶复合体载体，是将DNA支架序列、TALE1‑ugpG和TALE2‑welB构建到pBBR1SMCS‑BB质粒中获得的；本发明的多酶复合体载体通过模拟底物沟道传递效应，提高威兰胶的表达。将本发明成功构建的多酶复合体表达载体整合到威兰胶菌株中，获得的重组菌株发酵威兰胶的产量较野生菌株显著提高，为威兰胶的工业化生产奠定基础。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种提高威兰胶表达的多酶复合体载体及高产威兰胶的重组菌。

背景技术

威兰胶(Welan gum，曾编号S-130)又名威伦胶、韦兰胶或沃伦胶，是由革兰氏阴性鞘氨醇单胞菌合成的一种胞外杂多糖，分子量可以高达数百万，它是美国KELCO公司开发的继黄原胶和结冷胶之后，目前最具有市场应用前景的微生物多糖之一。

威兰胶的主链主要由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖按顺序组成的四糖重复单元构成，其合成过程为多酶级联反应。目前，国内关于威兰胶的研究工作主要为威兰胶菌种选育、摇瓶培养基优化、威兰胶流变学性质及其影响因素等方面，其生产方法是鞘氨醇单胞菌属利用天然的碳水化合物在细胞内发酵后分泌至胞外，天然微生物生产发酵产量较低，难以满足人们对新型微生物多糖的需求。

生物合成胞外多糖的过程需要多种酶的参与，作用机制十分复杂。关于威兰胶的具体合成途径尚处于探索之中。根据前期的研究报道，鞘氨醇胶的合成基因具有较高的同源性，表明他们具有非常类似的合成机制。根据结冷胶的合成途径推测威兰胶具体的生物合成途径发现，在威兰胶的合成途径中，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UgpG)将葡萄糖转化为UDP-葡萄糖后，糖基转移酶——葡萄糖磷酸异戊二烯转移酶WelB接着将葡萄糖-1-磷酸从UDP-葡萄糖上转移并整合到脂载体磷酸异戊二烯(IP)上，合成葡糖基-异戊二烯磷酸。UgpG催化形成的产物是WelB作用的底物，两种酶催化的反应是天然的级联酶促反应，在威兰胶合成过程中有重要意义。

随着人们对微生物多糖合成途径及关键酶的不断探索，通过微生物多糖的代谢工程来提高微生物多糖产量的方法取得了很大进展。但是仅通过改变代谢酶活性及提高代谢酶含量或敲除竞争途径的方法并不一定能够起到提高目标产物产量的目的，有时还会引起胁迫效应，反而降低目标产物产量。近年来，人们在细胞内代谢途径中发现了许多天然的多酶复合体，通过底物沟道传递效应使代谢酶的催化效率大大提高。受底物沟道传递效应的启发，人们试图采取构建人工支架的方式，在空间上拉近级联酶的距离，构建多酶复合体，模拟底物沟道传递效应，提高级联酶的催化效率。但是传统的人工支架如DNA支架、RNA支架和蛋白质支架由于自身的缺陷，限制了他们在体内的应用。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种提高威兰胶表达的多酶复合体载体及高产威兰胶的重组菌。本发明利用TALE与DNA支架的特异性相互作用构建人工支架，将威兰胶合成过程中的代谢酶进行空间组装，构建多酶复合体，模拟底物沟道传递与加工机制，建立代谢酶空间组织工程的方法，构建威兰胶高产菌株，为后续重组菌发酵生产威兰胶奠定基础。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高威兰胶表达的多酶复合体支架，包括DNA支架序列、TALE1-UgpG和TALE2-WelB；

其中，所述DNA支架序列包含11个重复单元，每一个重复单元包括一个结合基序BM1和一个结合基序BM2；所述结合基序BM1和结合基序BM2之间有6bp的间隔序列；

所述结合基序BM1的核酸序列为：5’-CTGCCCTCCTGGTT-3’；

所述结合基序BM2的核酸序列为：5’-CCAGAAACAACACT-3’；

所述TALE1-UgpG的编码序列如SEQ ID NO:12所示；