[发明专利]一种达巴万星前体A40926B0高产菌株及应用

说明书

本发明提供一种达巴万星前体A40926B0高产菌株及应用，所述高产菌株分类命名为：哥伦扎诺野野村菌L71(Nonomuraea gerenzanensis)，保藏号：CGMCC No.21334。通过将A40926B0生物合成基因簇导入出发菌株中，产生的次级代谢产物，经酯化、酰胺化、水解三步反应合成后筛选得到，产量比出发菌株提高50％～55％。达巴万星为新型半合成糖肽抗生素，能抑制革兰氏阳性菌细胞壁的生物合成，适用于治疗急性细菌性皮肤和皮肤结构感染。本发明的哥伦扎诺野野村菌L71能提高达巴万星前体A40926B0产量。本发明使用范围广泛，为放线菌药物高效生物合成途径的构建提供一种新的研究方法。

技术领域

本发明属于微生物制药领域，涉及一种达巴万星前体A40926B0高产菌株及应用。

背景技术

由于细菌耐药性问题日趋突出，如金葡球菌对β一内酰胺类抗生素及万古霉素耐药株的增加，肠球菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类抗生素以及万古霉素耐药株的增加；替考拉宁与万古霉素存在部分交叉耐药的情况，以及一些肠球菌具有中度或高度传递性耐药性的能力等，寻找新的糖肽类抗生素已成为临床治疗迫切的需要。

达巴万星(Dalbavancin)于2014年由Durata Therapeutics公司申请获美国FDA批准上市，商品名为Dalvance，是首个获批用于急性细菌性皮肤和皮肤结构感染治疗的双剂量方案的静脉注射抗生素。临床试验表明，达巴万星对于青霉素敏感和耐药的肺炎链球菌均表现出高度敏感的抗菌效果，是能治疗多重耐药的金黄色葡萄球菌和肠球菌属感染性疾病的少数药物之一，且具有万古霉素和替考拉宁没有的抗淋病奈瑟球菌的作用。

哥伦扎诺野野村菌L70是达巴万星前体A40926B0的生产菌株，目前发酵产量低。因此利用合成生物学理念与技术进行基因工程改造以提高A40926B0的发酵产量，对达巴万星产业化具有重要意义。

发明内容一种达巴万星前体A40926B0高产菌株

本发明的目的是提供一种达巴万星前体A40926B0高产菌株，为哥伦扎诺野野村菌L71，分类命名为：Nonomuraea gerenzanensis L71，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号：CGMCC No.21334，保藏日：2020年12月7日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的另一目的是提供一种达巴万星前体A40926B0高产工程菌株的构建方法，包括将A40926B0生物合成基因簇导入出发菌株哥伦扎诺野野村菌L70，筛选获得高产A40926B0的基因工程菌株哥伦扎诺野野村菌L71。出发菌株哥伦扎诺野野村菌L70保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.21333，分类命名：哥伦扎诺野野村菌(Nonomuraea gerenzanensis)，保藏日期：2020年12月7日。

本发明构建方法具体步骤如下：

(1)设计特异性引物以哥伦扎诺野野村菌L70基因组BAC文库为模板，扩增SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，筛选包含完整A40926B0生物合成基因簇序列的单克隆菌落：上部筛选引物SEQ ID NO.4：CGTTGAACTGGGTGGACATG，SEQ ID NO.5：TGGGACCTGCTGGAGGAG内部筛选引物SEQ ID NO.6：GCAACATGGTTGTCAGTCTG，SEQ ID NO.7：CTCTCGGTAGAGATCCACTTC下部筛选引物SEQ ID NO.8：GTAGTGGATGGCGAGCCAC，SEQ ID NO.9：GCTGGTACGGGACAAGGTC。

(2)步骤(1)中筛选到的包含完整A40926B0生物合成基因簇表达载体pMSBBAC1-A40926-1的单克隆菌落通过双亲本接合转移转入大肠杆菌E.coil ET12567/pUB307中；