[发明专利]一种卤化酶重组表达载体制备方法及其应用

说明书

本发明以链霉菌Streptomyces sp.FJS31‑2基因组为模板，特异引物扩增卤化酶片段，TA克隆，T载体通用引物进行菌液PCR鉴定，abx H/T质粒BglⅡ和HindⅢ限制性内切酶切鉴定并胶回收目的片段，连接相同酶切并去磷酸化处理的质粒载体，连接产物室温过夜连接，转化克隆菌株JM109感受态细胞。进行特异引物菌液PCR鉴定，扩增出目的条带的阳性克隆提质粒限制性内切酶酶切鉴定，切出载体片段和插入的目的条带。测序验证的阳性菌转化表达菌株BL21（DE3）Rosetta感受态细胞，特异引物菌液PCR鉴定。在不同温度下进行IPTG诱导表达，蛋白样品处理，SDS‑PAGE蛋白质电泳分析，可见很明显的诱导蛋白条带，卤化酶大小为65KD。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体为一种卤化酶重组表达载体制备方法及其应用。

背景技术

卤化物是含有卤素原子氟、氯、溴或碘的一类有机化合物。大多数卤化物具有重要的生物活性，许多临床上使用的抗生素和抗肿瘤药物都是微生物来源的卤化物，如具有抗菌活性的氯霉素、万古霉素，具有抗肿瘤活性的蝴蝶霉素、C-1027等。2014年批准上市的4个新型抗生素中3个为卤化物，分别为Dalvance、Oritavanci、Sivextro.

卤化物中的卤素原子对卤化物的生理活性有重要的影响，不但可以有效提高化合物的相关活性，并可延长半衰期，增加生物利用度。传统的卤化物挖掘主要依靠纯培养的方法，此方法的发现重复率高且不具有定向性。

利用微生物也是卤化物发现的重要来源。

发明内容

本发明的目的在于上述背景技术基础上，利用微生物技术，提供一种卤化酶异源表达载体及其构建。

为达到上述目的，采用的技术方案为：

所述卤化酶序列如SEQ ID NO.1所示；

1).根据链霉菌Streptomyces 31-2基因组测序结果设计编码基因的完全编码区扩增引物，Halo编码基因上下游引物分别加入了限制性内切酶BglⅡ和HindIII识别位点，引物HaloER的序列为：5'-CCCAAGCTTCGGCATGGCGGTCTTCATGT-3'，引物HaloEF的序列为：5'-GGAAGATCTATGGACACGACAGACACAGGCG-3'；

2).HaloEF/ER卤化酶特异引物以Streptomyces sp.FJS31-2基因组DNA为模板扩增，PCR产物纯化，TA克隆，通用引物M13F/M13R进行PCR验证，测序验证阳性克隆，菌株Halo-T用限制性酶BglⅡ和HindⅢ双酶切，双酶切片段连接相应酶切并去磷酸化处理的表达载体pET-32a，室温反应6h，转化JM109感受态细胞，特异引物菌液PCR鉴定及质粒酶切鉴定，测序鉴定，得到原核表达质粒载体pET-halo；最后得到阳性克隆菌质粒转化BL21(DE3)Rosetta感受态细胞，特异引物菌液PCR鉴定，确定阳性克隆菌；

3).取阳性克隆菌pET-halo的质粒和pET32a质粒100ng，转化大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta感受态细胞，转化子过夜培养、T7启动子引物菌液PCR鉴定后，得到重组质粒的基因工程菌pET-haloBL21和pET32aBL21；

4).取前述2种基因工程菌各50μL，分别接种于5mL浓度为100ng/μL氨苄西林的LB液体培养基中220r/min，37℃培养3h后分别接种100mL浓度为100ng/μL氨苄西林的LB液体培养基中220r/min，37℃培养至OD600＝0.3时，取5mL上述培养物分装至50mL无菌离心管，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，置于恒温摇床诱导6h；取1mL诱导后培养物，4000r/min离心5min，菌体沉淀加入100μL的5×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，置于99℃金属浴中裂解10min，12000r/min，室温离心10min，上清液即为菌体总蛋白裂解液；