[发明专利]用于治疗苯丙酮尿症的工程益生菌

权利要求书

1.一种用于治疗苯丙酮尿症的工程益生菌，其为大肠杆菌Nissle 1917衍生菌，在基因组上整合了外源L-苯丙氨酸解氨酶基因、L-苯丙氨酸内运蛋白基因和L-氨基酸脱氨酶基因。

2.如权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，所述L-苯丙氨酸解氨酶基因是stlA(SEQ ID NO:1)；所述L-苯丙氨酸内运蛋白基因是pheP(SEQ ID NO:2)；所述L-氨基酸脱氨酶基因是pma(SEQ ID NO:3)。

3.如权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，所述大肠杆菌Nissle 1917衍生菌的基因组中敲除二氢吡啶二羧酸合酶基因dapA。

4.如权利要求3所述的工程益生菌，其特征在于，其基因型为Nissle 1917(yicS::pfnrs-stlA,malPT::pfnrs-stlA,malE::pfnrs-stlA,lacZ::pfnrs-pheP,agaI::pfnrs-pheP,exo::ptac-stlA,rhtCB::ptac-stlA,araBD::para-pma,△dapA)。

5.一种构建如权利要求1-4中任一项所述工程益生菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.以大肠杆菌Nissle 1917为底盘菌，分别在基因组的yicS位点、malPT位点、malE位点、exo位点和rhtCB位点中的一个以上位点敲入L-苯丙氨酸解氨酶基因，获得stlA因整合菌株；

B.对于步骤A中获得的stlA因整合菌株，在其基因组的lacZ位点和agaI位点中的一个以上位点、优选两个位点敲入L-苯丙氨酸内运蛋白基因pheP，得到stlA+pheP整合菌株；

C.对于步骤B中获得的stlA+pheP整合菌株，在其基因组的araBD位点敲入L-氨基酸脱氨酶基因，得到stlA+pheP+pma整合菌株。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：

对于步骤C中获得的stlA+pheP+pma整合菌株，敲除其基因组中的二氢吡啶二羧酸合酶基因dapA，得到stlA+pheP+pma△dapA菌株。

7.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，基因stlA、pheP、pma的敲入和基因dapA的敲除通过基因编辑技术实施，所述基因编辑采用CRISPR-Cas9系统、CRISPR-Cpf1系统、CRISPR-Cas相关的转座系统INTEGRATE系统或者CAST系统。

8.如权利要求1-3中任一项所述的工程益生菌在制备苯丙酮尿症治疗药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述苯丙酮尿症是苯丙氨酸羟化酶基因突变Pah^R408W引起的。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物是口服制剂。