[发明专利]用于鉴定集落形成细胞的测定

说明书

本发明涉及一种用于检测分化的造血细胞的方法，其包括以下步骤：a)在支持物上以1‑1000个细胞的组分离未分化的造血干细胞，b)通过提供包含生长因子的细胞培养基使分离的细胞增殖以形成分化的造血细胞的细胞集落，c)使所述细胞集落与一种或多种标记缀合物接触，所述标记缀合物包含至少一个检测部分和至少一个针对CD14、CD235a和CD15的抗原识别部分，d)检测用所述标记缀合物标记的细胞集落中分化的造血干细胞的相对量。

技术领域

本发明涉及用于检测或鉴定集落形成细胞和区分衍生自那些细胞，尤其是造血干细胞(HSC)的集落的测定和方法。

背景技术

造血干细胞(HSC)像每种干细胞一样，可以自我更新并同时产生造血祖细胞，造血祖细胞将随后并最终向淋巴谱系分化(产生T-、B-和NK-细胞)，和向骨髓谱系分化(产生红细胞、血小板、粒细胞、巨噬细胞等)。在长时间的实验后，很明显，在人类中，具有分化成若干种多谱系祖细胞的能力的细胞是CD34+细胞群。实际上，这在小鼠模型体内以及造血干细胞移植(HSCT)环境中都得到了证实。体外最可靠、容易和存在已久的测定是集落形成细胞(CFC)测定，也称为甲基纤维素测定。该测定基于CD34+细胞分化成不同集落的能力，然后可对其进行计数和表征。

在经典的CFC测定中，将一定数量的CD34+细胞(通常在250-500个细胞之间)铺在35 mm皿上的1.1 ml能够支持骨髓谱系分化的培养基中。该培养基由补充有细胞因子(例如SCF、Flt3配体、TPO、IL3和IL6等)、胎牛血清和甲基纤维素的IMDM组成，以制备高粘度的培养基。其背后的想法是细胞将不能在液体培养基内自由移动，而是细胞将保持在甲基纤维素半固体培养基中的某一位置。这样，在孵育约14天后，该35 mm皿将含有许多不同的集落，至少理论上每个集落衍生自单个CD34+细胞，使得随后测量能够形成集落的CD34+百分比和集落类型成为可能。这样，在使用倒置显微镜观察后，使用形态学和表型标准，基于它们含有的成熟细胞的数目和类型，对衍生自不同类型祖细胞的集落进行分类和计数。图1显示了来自35 mm皿的CFC集落测定的典型结果。点代表不同类型的集落。

在已知甲基纤维素CFU测定中形成的集落分为以下类别：红细胞系集落形成单位(CFU-E)、红细胞系爆裂形成单位(BFU-E)、巨噬细胞集落形成单位(CFU-M)、粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)和粒细胞-红细胞系-巨噬细胞-巨核细胞集落形成单位(CFU-GEMM)。

BFU-E含有多于200个早期成红细胞，且通常存在于3-8个密集堆积的簇中。CFU-E比BFU-E小，并含有8-200个红细胞祖细胞，通常存在于一个或两个密集堆积的簇中。由于含有血红蛋白的细胞，CFU-E和BFU-E都具有深红/橙色至褐色的颜色。CFU-GEMM呈现出致密区，该区域通常位于半透明细胞的外围平坦菌苔的中心，该半透明细胞可以是大的或小的(“煎蛋”外观)。

因为CFU-GEMM也含有成红细胞(取决于血红蛋白化的水平)，含有血红蛋白的细胞的颜色可以从深红/橙色变化到褐色。CFU-G通常是扁平的，且由20-40个半透明的具有发育(germinative)中心的小细胞组成。最后，CFU-M是稀疏生长的，由20个半透明的大细胞组成的扁平集落，而CFU-GM也是扁平集落，由20-50个半透明的小和大细胞组成。图1描述了CFU测定的典型结果，其中可以看到不同类型的集落并最终仅基于如前所述的形态学和表型标准进行计数。图2以更高的放大倍数示出了不同的集落类型。

不幸的是，目前通过利用形态学和表型标准对集落进行计数的方式可能有偏差，并且很大程度上取决于对它们进行计数的人的经验。为了确定易变程度，我们进行了若干个实验，其中我们要求若干个研究人员在14天的孵育期后对含有集落的相同35 mm皿进行计数。