[发明专利]通过切向流过滤纯化mRNA

说明书

本公开提供了纯化mRNA分子的方法，所述方法包括：(Ia)从包括沉淀的mRNA分子的悬浮液中纯化沉淀的mRNA分子；(Ib)洗涤并溶解经纯化的沉淀的mRNA分子；(IIa)使用包括螯合剂的溶液纯化所述mRNA分子；随后是(IIb)洗涤经纯化的mRNA分子，其中步骤(Ia)到(IIb)是使用切向流过滤执行的。

本发明涉及纯化mRNA分子的方法，所述方法包括：(Ia)从包含沉淀的mRNA分子的悬浮液中纯化沉淀的mRNA分子；(Ib)洗涤并溶解经纯化的沉淀的mRNA分子；(IIa)使用包含螯合剂的溶液纯化所述mRNA分子；随后是(IIb)洗涤经纯化的mRNA分子，其中步骤(Ia)到(IIb)是使用切向流过滤执行的。

遗传信息作为脱氧核糖核酸(DNA)储存在细胞中，并且可以在需要时转录成核糖核酸(RNA)。DNA分子和RNA分子两者均由核苷酸构成，所述核苷酸由含氮碱基、五碳糖和至少一个磷酸基团组成。存在不同类型的RNA分子，包括携带用于蛋白质合成的遗传信息的mRNA分子。在真核细胞中，这些mRNA分子从DNA中转录作为早熟mRNA分子，并且随后通过添加例如5'帽和3'聚腺苷(poly(A))尾进行修饰。然后将成熟mRNA分子从细胞核转移到细胞质中，所述成熟mRNA分子在细胞质中翻译为蛋白质。因此，DNA序列以及成熟mRNA分子的量、稳定性和翻译效率主要决定了细胞中的蛋白质合成。

为了优化细胞中所期望蛋白质的合成，例如在治疗背景下，基于mRNA的方法代表了有前景的工具。使用mRNA分子的优点在于，必须将分子仅引入到细胞的细胞质中以进行蛋白质翻译(Tavernier等人,2011,J Control Release,150(3):238-247；Yamamoto等人,2009年,Eur J Pharm Biopharm,71(3):484-489)。此外，与适当载体(如质粒)中包含的相应DNA序列的使用相比，使用mRNA分子难度更低、更有效并且避免了在质粒或其部分并入到基因组中时改变染色体DNA的相当大的风险。mRNA分子主要通过体外转录产生，例如在治疗应用中。此类方法基于DNA模板，DNA模板通过质粒DNA本身的线性化或通过质粒DNA的聚合酶链式反应(PCR)产生。这两种方法是公认的并且可以轻松扩大规模。然而，在这两种情况下，mRNA分子都必须被纯化，之后才可以将其用于下游应用中。

所合成的mRNA分子的纯化至关重要，因为污染物会对大多数下游应用产生负面影响，尤其是在治疗背景下。不同副产物可能污染所期望的mRNA分子，如在如mRNA合成等上游过程中使用和/或产生的组分。在体内方法和体外方法两者的情况下，短mRNA分子片段可以例如通过水解和无效(流产，abortive)转录发生。mRNA分子水解可以在存在催化剂或酶的情况下发生，但也可以自发地发生，并且导致相应mRNA分子降解并形成可变长度的mRNA分子片段。在无效转录的情况下(参见例如Revyakin等人,2006,Science,314(5802):1139-1143)，RNA聚合酶与DNA分子中的相应启动子元件结合以进行转录，解开围绕转录起始位点的DNA双链，并且从mRNA分子的合成开始。然而，在一些情况下，RNA聚合酶不会脱离DNA的启动子区域，而是在转录DNA分子的一部分时保持静止。当解链的DNA在酶内累积时，RNA聚合酶会排出DNA中的储存转录遗传信息的部分，并释放长度为1到15个核苷酸的所合成的RNA分子(参见例如Goldman等人,2009,Science,324(5929):927-928)。为了避免例如在施用包含此类短mRNA分子片段的药物组合物时产生不期望的免疫应答，高度期望获得经纯化的非片段化mRNA分子以用于进一步的下游应用，特别是在治疗背景下。