[发明专利]一种施氏鲟精子的保存方法与复苏方法

说明书

本发明提供了一种施氏鲟精子的保存方法与复苏方法，包括如下步骤：(1)将施氏鲟精子与5‑10倍量的防冻剂混合均匀，然后分装至无菌容器中；(2)将步骤(1)中分装后的施氏鲟精子混合液预冷降温至3‑5℃，恒温保存10‑20分钟，然后以‑1℃/min的降温速度将混合液降温至‑15‑‑20℃，恒温保存5‑10分钟，然后以‑3℃/min的降温速度将混合液降温至‑40‑‑50℃，恒温保存1‑5分钟，然后以‑5℃/min的降温速度将混合液降温至‑80‑‑100℃，恒温保存1‑5分钟；(3)将步骤(2)中得到的混合液放入液氮中，即成。本发明所述的施氏鲟精子的保存方法采用分装与降温恒温的方式对精子进行冷冻保存，使精子在0‑40℃的结晶危险区内减少晶体的生成，保证细胞的结构完整。

技术领域

本发明属于施氏鲟繁育领域，尤其是涉及一种施氏鲟精子的保存方法与复苏方法。

背景技术

施氏鲟属硬骨鱼纲、幅鳍亚纲、硬鳞总目、鲟形目，主要分布于阿穆尔河(中国黑龙江)流域，因具有生长速度快、抗病力强、经济价值高等优点，已成为中国备受欢迎的养殖品种，占中国鲟鱼总产量的50％，而且仍有增加的趋势。但由于养殖技术粗放、养殖密度过高，导致疾病暴发频率升高，给鲟养殖业的健康可持续性发展造成了极大阻碍。近年来，科研工作者在施氏鲟资源保护、人工蓄养、人工繁殖、胚胎发育、性腺发育等方面做了大量工作，为保护施氏鲟种质资源提供了理论依据。但对于施氏鲟的精子保存以及精子质量还有待进行深入研究。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种施氏鲟精子的保存方法与复苏方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种施氏鲟精子的保存方法，包括如下步骤：

(1)将施氏鲟精子与5-10倍量的防冻剂混合均匀，然后分装至无菌容器中；

(2)将步骤(1)中分装后的施氏鲟精子混合液预冷降温至3-5℃，恒温保存10-20分钟，然后以-1℃/min的降温速度将混合液降温至-15--20℃，恒温保存5-10分钟，然后以-3℃/min的降温速度将混合液降温至-40--50℃，恒温保存1-5分钟，然后以-5℃/min的降温速度将混合液降温至-80--100℃，恒温保存1-5分钟；

(3)将步骤(2)中得到的混合液放入液氮中，即成。

进一步，所述的步骤(1)中的防冻剂包括氯化钠1-3份，氯化钾1-3份，柠檬酸钠5-10份，磷酸氢钠1-3份，人参皂苷0.1-0.5份，大豆卵磷脂1-5份，青霉素0.1-0.5份，乳糖5-10份，VE 0.5-1份，培养水60-80份。

优选的，所述的步骤(1)中的防冻剂包括氯化钠1.8份，氯化钾1.5份，柠檬酸钠6.5份，磷酸氢钠1.2份，人参皂苷0.1份，大豆卵磷脂3份，青霉素0.15份，乳糖6.2份，VE 0.8份，培养水72份。

进一步，所述的培养水为施氏鲟养殖用水。

一种施氏鲟精子的复苏方法，包括如下步骤：

(1)将冷冻后的无菌容器进行水浴加热，水温25-30℃，加热至无菌容器中含有少量固体时，加入1-3倍量的激活剂，混合均匀后使其放置于2-5℃环境下直至全部融化即成。

进一步，所述的激活剂包括DMSO 1-5份，氯化钠1-3份，氯化钾1-2份，海藻糖6-8份，乳糖5-10份，蔗糖6-10份，白藜芦醇1-5份，头孢噻呋0.1-0.5份。

优选的，所述的激活剂包括氯化钠3份，氯化钾2份，海藻糖6.5份，乳糖8.5份，蔗糖7.5份，DMSO 3.2份，白藜芦醇4份，头孢噻呋0.2份。

进一步，所述的激活剂的pH值为7.8-8.5。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：