[发明专利]一种牛奶体细胞分离过程优化工艺

权利要求书

1.一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，包括分离牛奶体细胞沉淀过程和RNA提取过程。

2.根据权利要求1所述的一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，所述分离牛奶体细胞沉淀过程，包括如下步骤：

S1：使用15mL离心管收集新鲜奶样；

S2：每头牛挤出的鲜奶分别装至4个或若干个15ml离心管，1800r/10min/室温离心；

S3：弃掉乳清和乳脂，每管用1-2ml PBS吹打混匀沉淀，此步之后也可全部转移到同一个15mL离心管后再离心；

S4：1500r室温离心5min，弃乳清和乳脂，尽量除去残留乳脂，每管加400μL Trizol裂解液，静置后带回实验室。

3.根据权利要求2所述的一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，所述S4中Trizol裂解液的主要成分是苯酚，Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。

4.根据权利要求2所述的一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，所述S4中具体操作为，室温静置15分钟后放入干冰，再带回实验室。

5.根据权利要求1所述的一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，所述RNA提取过程，包括如下步骤：

S11：采用AM1561试剂盒；

S12：将15ml离心管中的裂解物转移至1.5ml离心管；

S13：加入1/10裂解物体积的miRNA Homogenate Additive匀浆添加剂，到细胞裂解液中，颠倒混匀，冰浴10min；

S14：加入等于初始裂解物体积的RNA提取液，125：24：1，涡流30-60s混匀，10000g室温离心5min，小心的将水相，水相即上层，转移到新的EP管中，记录体积；

S15：加入1.25倍水相体积的室温放置的100％的乙醇到水相中，混合均匀；

S16：为每个样本准备一个Filter Cartridge滤筒，安装到收集管上；

S17：转移裂解液/乙醇混合相到Filter Cartridge中，超过700μL要分次转移；

S18：10000rpm，离心15s，弃滤液，重复以上步骤，直到所有裂解液/乙醇通过滤膜，重复步骤S7、S8将每头牛分装的4管样品合并成1管；

S19：加入700μL miRNA Wash Solution 1，10000rpm离心约5-10sec，弃滤液；

S20：加入500μL Wash Solution 2/3，10000rpm离心约5-10sec，弃滤液，重复两次；

S21：将Filter Cartridge放回收集管，10000rpm离心1min，离净残液；

S22：转移Filter Cartridge到一个新的收集管中，加入30-100μL常温的去RNA酶的水，即DEPC水，以最大速度，离20-30s。

6.根据权利要求6所述的一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，所述S14中RNA提取液的配制，包括如下步骤：

S31：取1.5mL PCR管，加入待检样本液180μL；

S32：加入提取液60μL，混匀，100℃水煮15～20min；

S33：取出，剧烈振荡5～10s，12000rpm离心15s；

S34：取上清液3～5μL作为RNA模版。

7.根据权利要求6所述的一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，所述S22中DEPC水为DEPC处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水，无色液体。