[发明专利]一种基于C2c2的基因表达调控系统及其应用

说明书

本发明提供一种基于C2c2的基因表达调控系统及其应用。所述基因表达调控系统包括：报告酶表达模板、报告酶底物、无细胞蛋白表达系统、C2c2蛋白和crRNA；其中，所述报告酶表达模板经转录和/或翻译后得到报告酶；所述无细胞蛋白表达系统将所述报告酶的mRNA翻译为报告酶；所述C2c2蛋白与crRNA结合后形成的剪切复合物，目标RNA激活所述剪切复合物，而后被激活的剪切复合物切割所述报告酶的mRNA。本发明通过待测目标物激活C2c2:crRNA复合物的附带切割效应，调控蛋白表达，并结合报告酶对底物的催化作用，实现酶促的级联放大，简单、快速且灵敏地对目标核酸分子进行特异性检测。

技术领域

本发明属于生物医学和分子生物学领域，具体涉及一种核酸的快速检测方法，尤其涉及一种基于C2c2的基因表达调控系统及其应用。

背景技术

全基因组测序是一种先进的核酸检测技术，能够获得海量、精准的核酸信息，但其检测耗时长(超过3天)、成本高，未能在医院中推广。RT-PCR技术是医院中常用的体外检测特定核酸片段的分子生物学技术，其成本相对较低、耗时较短，并且具有较高的灵敏度和特异性。然而，RT-PCR技术依赖昂贵仪器，检测能力有限，需要训练有素的操作员，无法应对突然剧增的病例。对于具有传染性的病毒而言，病毒感染者无法及时确诊和隔离，易导致病毒的扩散和蔓延。

尽管目前已经开发了许多用于检测核酸的方法，但它们不可避免地需要在灵敏度、特异性、简单性和速度之间进行权衡。例如，将等温核酸扩增(如RPA、LAMP、NASBA等)与便携式平台相结合的新方法，在护理点(POC)环境中提供了高检测特异性，但由基于这种技术的试剂盒开发要比常规PCR试剂盒复杂，涉及多对引物，人工操作步骤多，且假阳性率高。

Pardee等人首次成功地将基于合成生物学的细胞翻译机器转移到一个简单的纸盘上，通过样本中待测物寨卡病毒的RNA触发体外酶翻译系统，生成半乳糖苷酶，从而催化黄色底物变成紫色，产生比色信号。测试结果读取非常简单，颜色的改变即提示病原体的存在(详见Slomovic S,Pardee K,Collins JJ.Synthetic biology devices for in vitroand in vivo diagnostics[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2015,112(47):14429-14435.以及Takahashi MK,Tan X,Dy AJ,et al.Alow-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and hostbiomarkers[J].Nature communications,2018,9(1):1-12.)。目前的核酸检测技术输出信号多固定为荧光、比色和化学发光中的一种，输出信号的模式改变意味着需要改变整个信号扩增和转导策略，难以适应多场景下的应用。合成生物学的引入为解决目前核酸检测输出信号单一，无法满足多场景应用的难题提供思路。

CRISPR-Cas系统具有高灵敏度和特异性，因此在核酸检测中也起着至关重要的作用。最近开发的Cas家族效应器为开发具有各种目的的检测不同类型核酸的新策略打开了大门，使用CRISPR-Cas系统能够对基因组DNA，非基因组DNA，RNA和病原微生物基因组进行精确、高效的核酸检测(详见Aman R,Mahas A,Mahfouz M.Nucleic Acid Detection UsingCRISPR/Cas Bio-sensing Technologies[J].ACS Synthetic Biology,2020.)。上述方法不需要复杂的仪器，但操作步骤复杂，需要多次转移液体，有发生污染的可能。