[发明专利]利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法

权利要求书

1.一种利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

1)外植体的建立；

1.1)外植体的获得：以梨花器官作为外植体来源；

1.2)外植体的消毒；

1.3)外植体的预培养：将梨子房接种在PIM培养基上预培养；

2)体细胞胚诱导成苗：将预培养的子房在无菌条件下转移至IM培养基上培养，诱导体细胞胚分化成苗；

3)幼苗的倍性鉴定：选择健康叶片，利用解离液解离细胞后，用细胞流式仪鉴定倍性；

4)幼苗的扩繁。

2.根据权利要求1所述的利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法，其特征在于：所述步骤1.1)中选择嵌合多倍体梨9712为材料；选择梨盛花期前7天以未开花的花蕾和子房为建立外植体的材料。

3.根据权利要求2所述的利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法，其特征在于：所述步骤1.2)的具体步骤如下：将采摘的梨子房在25℃，清水冲洗6小时；用70％酒精摇晃消毒30秒；无菌水涮洗30秒，重复4次；用15％次氯酸钠消毒20分钟，期间摇晃4次；最后用无菌水涮洗30秒，重复4次。

4.根据权利要求3所述的利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法，其特征在于：所述步骤1.3)中PIM培养基的具体配方为：基本元素：1/2QL培养基的大量和微量元素，补充24mg/L EDTA螯合铁、250mg/L硝酸钾，97mg/L七水合硫酸镁，407mg/L硝酸铵；激素：0.2mg/L IBA；碳源：30g/L蔗糖。

5.根据权利要求4所述的利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法，其特征在于：所述步骤1.3)中预培养条件具体为：25摄氏度，暗培养4天。

6.根据权利要求5所述的利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法，其特征在于：所述步骤1.3)中接种方式具体为：在无菌的超净台中将无菌的花蕾连同下部的子房沿径向一切为二，露出花药和胚珠，切去多余花梗后，切割面朝下贴在培养基上。

7.根据权利要求6所述的利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法，其特征在于：所述步骤2)中IM培养基的具体配方为：基本元素：1/2QL培养基的大量和微量元素，补充24mg/L EDTA螯合铁、250mg/L硝酸钾，97mg/L七水合硫酸镁，407mg/L硝酸铵，2.2mg/L TDZ；激素：0.2mg/L IBA；碳源：30g/L蔗糖。

8.根据权利要求7所述的利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法，其特征在于：所述步骤2)中诱导体细胞胚分化成苗的培养条件具体为：25摄氏度，暗培养60天，培养30天后更换新的IM培养基。

9.根据权利要求8所述的利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法，其特征在于：所述步骤4)的具体步骤如下：在幼苗培养4周后，选择生长势健壮的组培苗，切除植株下部愈伤组织和多余的叶片，保留植株上半部约2～3cm，移入MS培养基中继代和培养，培养温度为25±2℃，光照培养，光源为日光灯，光照强度2000lx，光周期16h。