[发明专利]一种药刮法对兔KOA模型软骨细胞的实验方法

权利要求书

1.一种药刮法对兔KOA模型软骨细胞的实验方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、建立兔KOA模型；

步骤二、采用药刮法对兔的膝关节定期涂抹铁包金按摩膏；

步骤三、制备动物标本；

步骤四、对标本中的软骨组织进行形态学观察；

步骤五、对软骨组织中的caspase-3、caspase-9及XIAP蛋白免疫组化检测。

2.权利要求1所述的药刮法对兔KOA模型软骨细胞的实验方法，其特征在于，所述步骤1中的兔KOA模型具体建立步骤包括：

(1)将兔固定在仰卧位，并固定双后肢，于右后膝内侧备皮，微屈膝关节，以髌骨内侧下缘为进针点，消毒后使用1ml注射器穿刺，将针头沿穿刺点送入关节腔内，再将0.1ml的4％木瓜蛋白酶溶液注入，于造模开始第1、4、7天，每天注射一次，共注射3次；

(2)造模2周后随机取一只模型兔进行空气栓塞处死，暴露双膝关节，切断交叉韧带，去除半月板，大体观察对比股骨髁及胫骨平台软骨情况，当模型动物膝关节可见软骨表面变白、粗糙、缺损，有明显关节腔积液，证明兔KOA造模成功。

3.权利要求1所述的药刮法对兔KOA模型软骨细胞的实验方法，其特征在于，所述步骤二中的药刮法具体做法为：按照人和动物体表面积换算出动物体表面积比率，确定所用动物膝关节处所需铁包金按摩膏的用量，间隔一天采用刮痧板涂抹铁包金按摩膏，共计8-10次；采用刮痧板涂抹铁包金按摩膏时，单手握持刮痧板，将板放置掌心，一侧由拇指固定，另一侧由食指和中指固定，远心端与皮肤呈45°沿下肢长轴方向从上向下刮拭，移动范围在5cm以内，力度以皮色不变，可有轻微发热感而无皮肤破损为度，约为20-30N；刮痧频率为20-40次/分钟，操作时间平均8-10min，刮至皮肤微微发红，不出丘疹点即可。

4.权利要求1所述的药刮法对兔KOA模型软骨细胞的实验方法，其特征在于，所述步骤三中的动物标本制作过程为：待对兔KOA药刮法实验完成后，用1-3％戊巴比妥钠(30mg/kg)于兔耳缘静脉处静推，成功麻醉后，从右后膝内侧入路进入膝关节内，快速地手术切取右后膝关节股骨髁及胫骨平台部分关节软骨，修成体积为0.5x0.4x0.2cm³的组织块，标本制作完成。

5.权利要求1-4中任一项所述的药刮法对兔KOA模型软骨细胞的实验方法，其特征在于，所述步骤四中对标本中的软骨组织进行形态学观察过程包括：

(1)固定:将各组织块置于2-4％多聚甲醛溶液中，常温下固定2-3天；

(2)脱钙:将标本冲洗干净后放置在10％EDTA脱钙液中20-30天，存放在30-40℃恒温箱中，每7天需更换2次脱钙液(当用毫针能够轻松扎进软骨组织中时意味着可停止脱钙，进行下一步骤)；

(3)石蜡包埋：依次在75％，85％,95％和100％乙醇中梯度脱水，二甲苯透明，恒温箱中浸蜡3-4次，使用包埋机包埋，自然冷却后，-20℃冻过夜，取出倒置于冰上，切片机切片；

(4)60℃烤片1-2h；

(5)切片脱蜡/复水：首先用二甲苯浸泡各个切片8-10min，泡2次。再接着轮流放入100％，95％，85％和75％乙醇中，每梯度乙醇放置5min。最后用蒸馏水浸泡冲洗5-10min；

(6)苏木素染5-10min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝；

(7)伊红染3-5min，蒸馏水冲洗；

(8)梯度酒精(75-100％)脱水，每级5-10min，或者直接把片子烤干，取出后将其浸泡于二甲苯中10min，2次，用中性树胶进行封片处理。

(9)在光学显微镜下观察后拍照，图片保存留底，依据改良Mankin评分标准实行评分。